Rekombinantní toxiny

Někteří živočichové jsou vybaveni jedovými žlázami (štíři. hadi, pavouci), žahavými buňkami (mořské sasanky) či jedovými žlázkami v kůži (žáby). Ať už jim jedovatost slouží k odpuzení útočnika, nebo k ulovení potravy, je dnes jejich život do značné míry závislý na tom, jaké složení mají jejich toxické peptidy. Tito živočichové totiž vylučují i toxiny, které se vážou na iontové kanály, a buď blokují, nebo pozměňují jejich funkci. Toxiny s takto vyhraněnou vazbou umožňují studovat vazebná místa kanálů, lze je využít pro izolaci podjednotek, z nichž jsou receptory na kanály navázány. Například bungarotoxin z bungarů a kober byl využit pro izolaci acetylcholinového receptoru nikotinového typu, toxiny ze štírů přispěly k oddělení několika typů podjednotek sodíkových kanálů. Od izolace podjednotky už je pak jen krok k strukturální analýze a k určení oblastí bílkovinných řetězců, které jsou k aktivaci receptorů nezbytné.

Nové iontové kanály jsou objevovány neustále, ale často chybějí farmakologické nástroje pro jejich výzkum. „Nástrojem“ mohou být i přírodní toxiny s vysoce specifickými vazbami na iontové kanály. Například hanatoxin z chilského sklípkana Grammostola spatulata působí specificky na draslíkové kanály typu Kv2.l, tři nové heteropodatoxiny (o 40 aminokyselinách) z pavouka Heteropoda venatoria působí na draslíkový kanál Kv4.2. Nebo třeba peptidy snižující krvácení (BDS) z mořské sasanky Anemonia sulcata ovlivňují draslíkový typ Kv3.4, tertiapin ze včelího jedu blokuje další typy draslíkových kanálů.

Nové skupiny toxinů sice vědcům i studentům způsobují depresi z přemíry informací, ale především umožňují hlubší studium struktury a funkce mnoha dalších iontových kanálů.

Zdroje toxinů

• Přírodní jedy (ať živočišné, nebo rostlinné) jsou většinou vražedným koktejlem mnoha toxinů. Ten konkrétní, který chceme izolovat, představuje obvykle jen pár procent z celkového objemu. Takže s velkým úsilím získáváme malé množství toxinu. Krom toho mohou být potíže s jeho vyčištěním, tedy s izolací dostatečně čistých toxických bílkovin, které by neobsahovaly ani trochu jiného proteinu s odlišným účinkem. Navíc jsou někteří živočichové, o jejichž toxiny by byl zájem, velmi vzácní a jejich odchyt je nepřípustný z hlediska ochrany přírody.
• Uměle syntetizované peptidy. Toxiny lze získávat synteticky jako peptidy pouze tehdy, jde-li o krátké bílkovinné řetězce, jejichž přípravu proteinoví chemici ještě v laboratoři zvládnou. Tak jako tak je příprava čistých toxinů ekonomicky náročná. Například cena 1 mg tetrodotoxinu izolovaného z ježíka (čtverzubce rodu Tetrodon, někdy také ryby fugu, viz Vesmír 75, 235, 1996/4) převyšuje 500 marek. Ještě dražší je -konotoxin, poměrně nový typ blokátoru sodíkových kanálů kosterního svalu, který stojí přibližně 720 marek. Výrobní i ekonomické potíže oddalují využití toxinů v léčebné praxi, a proto se hledají způsoby jak získat toxiny levněji.
• Rekombinantní toxiny. V jeruzalémských Alomone Labs vyvinuli metody pro přípravu čistých a biologicky aktivních rekombinantních toxinů, kdy „výrobci“ jsou bakterie vybavené konkrétním programem, který je zabudován do kroužků DNA, plazmidů. Ve vhodných kmenech bakterií, zpravidla Escherichia coli, namnožili toxiny, poté je extrahovali a vyčistili. ¹⁾ Kontrola funkce těchto toxinů se provádí na příslušných iontových kanálech exprimovaných v oocytech žáby drápatky (Xenopus). Pečlivé testy ukázaly, že nové rekombinantní toxiny mají více než 99% čistotu a jsou stejně účinné jako toxiny přírodní.

  Možnosti využití

  Všimněme si charybdotoxinu, jednoho z rekombinantních toxinů, abychom získali alespoň představu o velkých možnostech využití. Charybdotoxin se používá ke studiu určitých typů draslíkových kanálů, které se mohou v různých tkáních lišit a které ovlivňují propustnost pórů pro draslík různými kombinacemi čtyř podjednotek, vznikajících alternativním sestřihem genů. ²⁾ Například v mozku a v hlemýždi vnitřního ucha se tvoří odlišné podjednotky b, které sice samy kanál neformují, ale obměňují jeho činnost. A podle vazby charybdotoxinu se poznají odlišnosti exprese draslíkových kanálů v různých tkáních.

  Kromě specifických toxinů používají neurobiologové celou řadu protilátek, které mohou také velmi dobře charakterizovat jemné rozdíly mezi příbuznými kanály. Zmiňme se alespoň o stále otevřeném draslíkovém kanálu TASK, který je necitlivý k napětí. Skládá se ze čtyř transmembránových domén a dvou domén kanálových. Existence dvou kanálových domén naznačuje, že stačí přítomnost dvou podjednotek ze čtyř, aby se vytvořil funkční pór, jímž by draselné ionty prošly membránou. Tyto stále otevřené kanály nacházíme v mnoha orgánech - v děloze, tenkém a tlustém střevě, srdci, ledvinách, plicích či mozku. A existenci otevřených draslíkových kanálů prokazujeme právě díky protilátkám proti jednotlivým podjednotkám kanálů.