Dědičné informace prvních buněk přečteny

V současném biologickém výzkumu mají významné místo tzv. genomové projekty, jejichž cílem je „přečíst“ úplnou dědičnou informaci některého biologického objektu. Tato dědičná informace je, jak známo, „zapsána“ v molekulách DNA. Soubor všech molekul DNA v buňce se nazývá genom.

Až dosud byly úspěšně dokončovány pouze projekty, jimiž se získala úplná dědičná informace virů, což nejsou v pravém slova smyslu organizmy, dále dědičná informace některých buněčných organel, například mitochondrií, a konečně jednotlivých chromozomů různých buněk. Znalost úplné dědičné informace skutečného organizmu, tj. objektu, jenž je schopen samostatného života, dosud chyběla.

Dědičná informace je v DNA zapsána pořadím čtyř typů kovalentně pospojovaných chemických sloučenin, zvaných nukleotidy. Přečtení této informace je založeno na určení pořadí nukleotidů v DNA – metodě, jíž se toho dosahuje, se nepříliš šťastně říká sekvencování DNA.

První molekulou DNA, jež byla sekvencována (přečtena), byl r. 1977 genom bakteriálního viru ΦX174 (5 386 nukleotidů). Následoval genom jiného bakteriálního viru, bakteriofága lambda (48 502 nukleotidů). Oba tyto fágy infikují buňky bakterie Escherichia coli. My jsme r. 1985 dokončili sekvenaci DNA bakteriofága PZA, infikujícího bakterii Bacillus subtilis (19 366 nukleotidů). Roku 1991 byla publikována úplná dědičná informace prvního živočišného viru, lidského cytomegaloviru (229 tisíc nukleotidů). Mezitím byla sekvencována i DNA hovězí a lidské mitochondrie, buněčné organely zapojené do energetického metabolizmu (187 tisíc nukleotidů).

Tyto projekty objasnily mnoho základních pozorování do té doby nevysvětlených a přinesly množství nečekaných výsledků. Například se ukázalo, že genetický kód není zcela univerzální, že se geny mohou překrývat, zjistilo se, jak vypadají úseky DNA řídící činnost genů aj.

Velmi se pokročilo se čtením dědičné informace kvasinky Saccharomyces cerevisiae, jež je rozdělena do šestnácti chromozomů. Několik z nich již bylo přečteno, u dalších se ve čtení značně pokročilo. Počítá se s tím, že by stanovení úplné dědičné informace kvasinky mělo být dokončeno r. 1997. To bude velký úspěch, protože kvasinka je sice mikroorganizmem, ale zároveň je představitelem nejjednoduššího eukaryotického organizmu. (Eukaryotické buňky, na rozdíl od prokaryotických, mají jádro. Vznik buněčného jádra je považován za jeden ze základních předělů v evoluci organizmů.)

Nejvíc pozornosti je ovšem věnováno projektu „Lidský genom“. Jeho cílem je přečíst asi tři miliardy „písmen“ lidské dědičné informace. To je však program dlouhodobý, který nebude dokončen v tomto století.

Mnozí badatelé se rozhodli, že bude velmi užitečné znát úplnou dědičnou informaci těch nejjednodušších „klasických“ objektů biologického výzkumu, zejména pak prokaryontních buněk. Mezi nimi dominuje bakterie Escherichia coli, vděčný experimentální objekt, na němž studium genetiky a biochemie pokročilo snad ze všech organizmů nejdále. Buňka této bakterie ovlivnila v minulosti biologický výzkum více než kterýkoliv jiný objekt. Získané údaje silně ovlivnily myšlení biologů. Ti v šedesátých letech usoudili, že vlastně není ani třeba příliš studovat vyšší organizmy, protože, jak se tehdy říkalo, „co platí pro bakterii, platí i pro slona“. Nemohli se však víc mýlit! V sedmdesátých, a zejména v osmdesátých letech se ukázalo, že se bakterie (prokaryonta) od vyšších živočichů (eukaryont) zásadně liší ve struktuře genomu, v základních životních pochodech, a především v mechanizmech jejich řízení a regulace.

Právě proto, tvrdí mnozí, je třeba „přečíst si“ co největší počet různých organizmů, od těch nejnižších a nejjednodušších a poměrně dobře prozkoumaných až po člověka.

Do čtení genomu Escherichia coli se pustilo několik skupin, zejména Američané. Nejvíce peněz na tento projekt získala skupina pracující na Wisconsinské státní univerzitě. Jinou ostře sledovanou bakterií, tentokrát spíše v evropských laboratořích, je Bacillus subtilis. Je to bakterie průmyslově významná, protože se používá k fermentační výrobě různých enzymů.

Netrpělivě se čekalo, až dědičná informace jedné z těchto dvou bakterií bude přečtena. Co se asi dozvíme? Budeme schopni říci, že jsme porozuměli životu? Že v dědičné informaci je zakódováno všechno, co dělá organizmus živým objektem? Nebo budeme zklamáni a zjistíme, že buď přečtené informaci nerozumíme, nebo nám stále chybí něco pro život důležitého, co v DNA není?

Jako opravdová bomba přišla vloni publikace v časopisu Science, popisující „první přečtenou bakterii“. Není to totiž ani Escherichia coli, ani Bacillus subtilis. V klidu a potichu, aniž by se o tom vědělo, pracoval na genomu bakterie Haemophilus influenzae tým čtyřiceti vědců vedený J. Craigem Venterem z Ústavu pro výzkum genomů (The Institute for Genomic Research neboli TIGR).

Craig Venter pracoval původně na projektu Lidský genom v Národních ústavech zdraví (NIH) poblíž Washingtonu. Neshodl se však s některými vedoucími tohoto projektu v názoru na strategii řešení. Nechtěl se např. pouštět do čtení toho, co považoval za „nezajímavou informaci“. Místo toho připravil „knihovnu“ genů, jež fungují v buňkách lidského mozku, a objevil tam mnoho nových zajímavých genů. Ačkoliv je ve všech buňkách organizmu přítomna ve formě DNA úplná dědičná informace, různé typy buněk z ní využívají jen malou specifickou část. Aby někdo tímto přístupem stanovil úplnou dědičnou informaci, musel by zpracovat všechny typy buněk, navíc ve všech stadiích jejich vývoje. To je prakticky nemožné, a stejně by ani pak nezískal úplnou informaci, protože mnohé geny jsou v běžných podmínkách nefunkční, neprojevují se, a v tomto typu knihoven se neobjeví. Navíc tvoří geny jen asi 5 procent celkové dědičné informace buňky. „Zbytek“ je DNA o neznámé funkci. Zejména se však tímto přístupem nepodaří stanovit strukturu úseků DNA regulujících zapínání a vypínání jednotlivých genů, což tvoří základ diferenciace buněk do různých tkání a orgánů.

Venter se osamostatnil a založil soukromý TIGR, kde se věnuje zavádění nových strategií čtení dědičné informace. První velký úspěch laboratoří TIGR je právě stanovení úplné dědičné informace bakterie Haemophilus influenzae, založené na jeho nové, na první pohled „chaotické“ strategii.

Některé kmeny této bakterie působí meningitidu, ušní infekce a infekce horních cest dýchacích, zejména u dětí. Laboratorní kmen, jenž byl k sekvenaci DNA použit, je neškodný. Bakteriální buňka obsahuje cirkulární chromozom, tvořený dvouvláknovou DNA dlouhou 1 830 137 nukleotidových párů.

Strategie, kterou použil Venter se spolupracovníky, je založena na rozbití bakteriální DNA na kousky o délce asi 1 500 až 2 000 nukleotidů. Tyto úseky byly sekvencovány standardními metodami s pomocí komerčních automatických zařízení pro elektroforézu (nazývaných automatické sekvenátory DNA, ačkoliv samotné sekvenační reakce provádí experimentátor a přístroj pouze analyzuje výsledek). Obvykle se jednou reakcí daří stanovit pořadí 400 až 500 nukleotidů. K pokrytí celého genomu bylo takto izolováno a analyzováno 19 687 kousků DNA. Mnoho jich bylo sekvencováno z obou konců, takže celkem bylo provedeno 28 643 analýz. Jednotlivé takto získané sekvence nukleotidů byly automaticky ukládány v počítači a speciálními programy se v nich vyhledávaly úseky, jimiž se vzájemně překrývají. Takto byly k sobě řazeny. V první fázi tak bylo získáno 140 souvislých nukleotidových sekvencí, tzv. kontigů. Ty pak byly spojovány cíleným sekvencováním chybějících úseků. Povedlo se tak v této druhé fázi stanovit nukleotidovou sekvenci 78 % genomu.

Zkušenost i z menších sekvenačních projektů ukázala, že sekvenace zhruba 90 % genomu trvá tak dlouho jako dokončení zbývajících 10 %. Proto Venter použil k dokončení sekvenace genomu Haemophilus influenzae několik poměrně nákladných metod – nevyhnul se tak i opakovanému sekvencování již hotových úseků DNA. V dokončené sekvenaci genomu byl každý nukleotid čten v průměru šestkrát.

Nyní tedy máme k dispozici úplnou dědičnou informaci buňky – nic nechybí a můžeme ji analyzovat. Předběžnou analýzu nejdůležitějších projevů života provedli samozřejmě v laboratořích TIGR. Zjistili, že složení DNA této bakterie je netypické, protože DNA v průměru obsahuje 62 % nukleotidů typu A a T a jen 38 % nukleotidů typu G a C. Některé specifické geny však mají zastoupení všech čtyř typů nukleotidů stejné (50 % G+C a 50 % A+T). Tato skutečnost usnadnila Venterovi a jeho kolegům práci. Sekvenace DNA s nízkým obsahem nukleotidů G a C je totiž podstatně snazší než sekvenace DNA s vysokým obsahem těchto nukleotidů. Celkem se v genomu podařilo identifikovat 1743 genů, z toho 736 genů nových o zcela neznámé funkci.

Autoři publikace popisující celou nukleotidovou sekvenci genomu bakterie Haemophilus influenzae hledali také geny, jež u divokého kmene způsobují patogenicitu. Ty jsou sice v neškodném laboratorním kmeni této bakterie neaktivní, ale jsou tam přítomny. Jsou to geny zapojené do syntézy lipopolysacharidů a je zajímavé, že v nich jsou opakované krátké úseky DNA (složené ze čtyř nukleotidů). Vyhledáváním těchto opakujících se tetramerů bude snad možné identifikovat další geny zapojené do patogenních projevů bakterie.

Celkově se autorům podařilo seskupit geny do několika funkčních tříd. Jsou to: třída genů zapojených do biosyntézy aminokyselin, základních stavebních jednotek proteinů (např. enzymů), dále třída genů zapojených do syntézy kofaktorů (sloučenin spolupůsobících s enzymy), do buněčných procesů, jakými jsou např. sekrece sloučenin z buňky a buněčné dělení, do syntézy buněčné stěny, do energetického metabolizmu, do syntézy tuků a cukrů, zejména polysacharidů, do syntézy nukleotidů, do replikace DNA, přepisu RNA a překladu RNA do proteinů (tyto tři poslední třídy genů vlastně zajišťují přenos a uchovávání genetické informace). Dále je to třída genů regulačních a genů zapojených do transportu sloučenin uvnitř buňky a do buňky. A pak je zde třída genů nezapadajících do žádné z těchto hlavních tříd a genů s funkcí neznámou.

Nedlouho po publikování sekvence DNA bakterie Haemophilus influenzae byla na témže pracovišti dokončena sekvenace pravděpodobně nejmenšího genomu, který ještě obsahuje veškerou informaci nezbytnou k životu buňky. Je to genom mikroorganizmu Mycoplasma genitalium, bakterie bez buněčné stěny, parazitující na buňkách epitelu. U člověka infikuje genitálie a respirační trakt. Genom tohoto mikroorganizmu je tvořen dvouvláknovou cirkulární DNA skládající se z 580 070 nukleotidových párů. Zdá se tedy, že něco málo přes půl milionu písmen je dostatečné množství k vytvoření informace pro „život“! Jestli však stačí pouze tato informace, či zda je k životu zapotřebí ještě cosi jiného, není zatím jasné.

DNA byla sekvencována strategií popsanou u sekvenace genomu bakterie Haemophilus influenzae. Bylo provedeno 9 846 sekvenačních reakcí, při průměrném plném vytížení osmi sekvenačních přístrojů denně. Přečtený genom obsahuje pouhých 470 genů. Většina má známou funkci. Ukazuje se, jak přesné a správné byly obecné informace o životních pochodech, získané mnohaletým úsilím metodami z dnešního hlediska těžkopádnými. K dobrému (zdaleka ale ne úplnému) porozumění životním pochodům jednoduchých organizmů, jakými jsou bakterie, máme snad již blízko. Shromážděním informací o genetické výbavě dalších organizmů, získávaných především velkými sekvenačními (genomovými) projekty, budeme moci lépe nahlédnout do mechanizmů vývoje života na Zemi.