Mikrobiální biofilm

O existenci bakterií v přírodě se ví všeobecně a také je všeobecně známo, že se bakterie pěstují na živných půdách ve skleněných nebo plastikových miskách. Rostou v malých kopečcích, jimž se trefně říká kolonie. Jak také jinak, když tímto způsobem bakterie kolonizují území, které jim pěstitel přidělil. Než však Robert Koch přišel na způsob jak pěstovat bakterie na pevných půdách, pěstovaly se po několik let v tekutinách, nejčastěji v bujonu. V něm se volně vznášely, plavaly a množily se, nebyl ale znám způsob jak je od sebe oddělit. To umožnily až Kochovy agarové půdy, díky nimž se dala získat čistá kultura a mohl začít zlatý věk bakteriologie. Ten byl naplněn studiem morfologie, fyziologie a genetiky bakterií – a vírou, že výsledky studia prozradí o bakteriích vše.

Překvapivě věrně kopírovala bakteriologie cesty počátků zoologie až na to, že se kabinety bakteriologů neplnily vycpanými bakteriemi. Bakterie byly hodnoceny podle toho, co o nich mikrobiolog zjistil ve své malé zoologické zahradě. Změřil je, namaloval, vyfotografoval, prozkoumal jejich metabolizmus. Stejně tak to dělali ostatní přírodozpytci, kteří studovali zvířata v zajetí. Nikoho nenapadlo, že by bakterie ve své přirozenosti žily jinak než jako plankton volně se vznášející v mořích nebo jako kolonie na výživné podložce. Chování bakterií v jejich přirozeném prostředí se prostě předvídalo podle výsledků výzkumu čistých kultur.

Z nedostatku pochyb o dogmatech upadla bakteriologie do pasti a ocitla se na scestí, což ovšem není tak vzácné. Dlouho platilo, že v žaludku člověka a jiných savců bakterie nemohou žít, protože je tam velmi kyselé prostředí (dnes víme nejméně o tuctu druhů, které v žaludku bývají). Také se nepředpokládalo, že by se některé bakterie mohly významně pomnožit v amébách jako legionely (gramnegativní nepohyblivé bakterie vyvolávající onemocnění dýchacího a cévního systému) nebo že se mikrob náročný na kultivační půdu nemůže přirozeně množit v chudém prostředí. Překvapení poskytly opět legionely. Trvalo dlouho, než jim podle rafinovaně sestaveného a kuriózního receptu mohla být nabídnuta bohatá kultivační půda, na jiné totiž nerostou. Přitom se ale dají snadno získat – z rezavé vody, kterou je naplněno ústřední topení.

V čem spočívá scestí, jež se tu poněkud dramaticky líčí? Dlouho nikoho ani nenapadlo pátrat po tom, jak žijí bakterie v přirozeném prostředí. Žije každá buňka sama pro sebe, nebo je ovlivňována ostatními a sama ovlivňuje druhé? Uplatňuje se už i u bakterií nějaký systém funkční diferenciace? Díky své fenotypové přizpůsobivosti představují bakterie nejúspěšnější formu existence života na Zemi. Mohou žít buď volně ve vodním prostředí jako plankton, nebo ve společenství, které vytváří tenkou vrstvu na pevných tělesech – biofilm.

Ukazuje se, že existence v biofilmu je pro bakterie z mnoha důvodů výhodnější a ve většině prostředí také je základním způsobem jejich přirozené existence. V přírodě mají bakterie přirozenou tendenci lepit se, přilnout na pevný povrch. Přirozené tekuté prostředí pro bakterie jsou potoky, řeky, oceány, ale i odpadní vody, žumpy a průmyslové organické odpady. Zde všude biofilm přináší problémy, neboť přinejmenším znečisťuje povrch, na němž se tvoří, a někdy jej i chemicky poškozuje korozí. Zvětšuje například odpor lodního trupu při plavbě a poskytuje základ pro usazování řas a mušlí. V trubkách biofilm způsobuje turbulenci protékající tekutiny, černání kovů redukovaným železem nebo hnědnutí manganem. Podílí se také na korozi ropovodů či nádrží paliva v letadlech. V průmyslových výměnících tepla tvoří tepelnou izolační vrstvu a snižuje jejich účinnost. Zmenšuje průsvit potrubí pitné vody.

Vhodné podmínky pro tvorbu biofilmu jsou také na cizích tělesech v lidském těle, jako jsou kanyly, katétry či plastikové protetické implantáty, kde bakterie mohou ohrozit léčbu, a tím i zdraví. Na druhou stranu biofilm střevní sliznice tvořený saprofytickými a symbiotickými bakteriemi člověka do jisté míry chrání před nevhodnými mikroby – i před patogeny.

Struktura biofilmu

K poznání struktury biofilmu nestačí běžné metody optické mikroskopie ani elektronová mikroskopie (mimo jiné proto, že nepracuje s živými objekty). Je nutno použít fyzikální a fyzikálněchemické metody. Například na konfokálním laserovém mikroskopu lze rastrovací technikou prohlížet plochy ve zvolené hloubce objektu. Biofilm se tak může zobrazovat jakoby v řezech a z nich lze poskládat celou prostorovou strukturu. Při snímání obrazů časosběrnou metodou se dá získat i animovaný záznam dějů probíhajících v biofilmu. Tloušťka biofilmu závisí na dostupnosti živin a na tom, zda je složen z jednoho či více bakteriálních druhů. V přirozeném prostředí je společenství více druhů obvyklejší. Naměřené hodnoty tloušťky biofilmu kolísají od několika téměř do stovky mikrometrů. Biofilm není homogenní, skládá se z agregátů a četných dutin. Jsou to spletité, vzájemně propojené kanálky rozmanitého tvaru. Pomocí mikroelektrod lze v něm měřit koncentraci kyslíku. Ta je důležitá pro společnou existenci bakterií aerobních (potřebujících kyslík) a anaerobních (žijících bez kyslíku). Koncentrace kyslíku na povrchu biofilmu je nízká, o trochu hlouběji stoupá a dále do hloubky podle očekávání klesá, takže v základní vrstvě je nulová. V různých vrstvách má biofilm různý elektrický náboj, což pomáhá transportu živin.

Z pozorování a měření byl vytvořen model architektury a funkce biofilmu. Bakterie jsou v něm rozloženy nerovnoměrně, rostou v mikrokoloniích, shlucích bakterií kuželovitého nebo houbovitého tvaru. Mikrokolonie jsou spojeny spletitými kanálky. Většími mikrokoloniemi kanálky procházejí, jsou však tenčí, představují jakési póry. Na povrchu je biofilm omýván okolní kapalinou obsahující molekuly živin. Ta proniká i do biofilmu a póry se dostává až do nitra mikrokolonií. Biofilm jediného bakteriálního druhu má jednodušší stavbu než biofilm obsahující společenství více druhů. Značná část experimentálního zkoumání byla prováděna s kulturami Pseudomonas aeruginosa.

Jak biofilm vzniká

Jestliže pohybující se (planktonické) buňky hladovějí, přichytí se svými aktivními molekulami na nějaký pevný povrch, který skýtá dostatečný přísun živin. Podle této funkce se těmto molekulám říká adheziny. Mohou to být molekuly látek různé povahy – bílkoviny, glykopeptidy, polysacharidy. Jakmile bakterie přilnou k povrchu, změní své chování, změní se jejich fenotyp. Produkují do prostředí velké množství polysacharidu, který je podobný škrobu a také má podobné lepivé vlastnosti. Hmotnost polysacharidu může být až stokrát větší než hmotnost bakteriálních těl, jež ho produkují. Z této látky vzniká hlenová matrice, která drží buňky pohromadě a vytváří lešení, v němž se buňky množí. Tvoří se mikrokolonie. Zároveň vznikají kanálky a již zmíněná složitá struktura. Některé buňky se také z mikrokolonií na určitý impulz odlučují, přecházejí do planktonického stavu (odplouvají) a kolonizují další části povrchu. Příčinou může být konkurence a neúnosnost další existence ve společenství. Chemické signály vycházející z buněk a umožňující buňkám zjišťovat existenci okolních buněk (a tím i hustotu populace) prostě dalšímu zhušťování populace zabrání. Tento již dosti prostudovaný jev je označován trefným termínem quorum sensing.

Co se v biofilmu děje

Pro biofilm má význam i tekutá fáze, která ho obklopuje. Biofilm je viskózní, elastický. V proudu tekutiny se jeho struktura chová dynamicky, vlní se. V silnějším proudu se posunuje po podložce a šíří se na neobsazená místa. Když elasticita nestačí udržet buňky pohromadě, části biofilmu se odtrhávají. Při dostatečné až nadbytečné koncentraci živin či zdroje energie v experimentu s glukózou se povrch biofilmu vyrovnává, vlnky zmizí a vytvářejí se opět při poklesu koncentrace glukózy.

Kapalina, která biofilm omývá zvenčí, přináší zužitkovatelné organické i anorganické látky a odnáší produkty metabolizmu. Do hloubky jsou – stejně jako kyslík – zanášeny již zmíněným systémem kanálků. Lze v nich pozorovat proudění, a dokonce byla změřena hydrodynamika protékající tekutiny. Kanálky mají poměrně velký průsvit, proudem tekutiny jsou snadno unášeny částice latexu o průměru 0,3