Život bez bakterií

Obor, který se zabývá odchovem zvířat v bezmikrobních a mikrobně definovaných podmínkách – gnotobiologie – je klíčem ke studiu vztahů mezi hostitelem a mikroby a také cestou k poznání mnoha lidských onemocnění.

„Ostatně si myslím, že život za takových podmínek by byl nemožný…“, napsal v osmdesátých letech 19. století světoznámý chemik a mikrobiolog Louis Pasteur. Pasteur měl na mysli život zvířat a rostlin za bezmikrobních (axenických) podmínek. Jeho korespondence s Marcelim Nenckim, který naopak prosazoval myšlenku, že bezmikrobní podmínky by umožnily delší a zdravější život, dala podnět k vytvoření přístrojů a metodik, které měly umožnit tento spor rozřešit a otázku možnosti či nemožnosti života bez bakterií zodpovědět.

Dne 24. června roku 1895 vědci Hans Thielfelder a George Nuttall z Berlínské univerzity [1] informovali o svých experimentech s odchovem bezmikrobních morčat. Povedlo se jim udržet naživu morče porozené císařským řezem, které dále žilo na sterilní mléčné stravě bez přítomnosti mikrobů po osm dnů trvání pokusu. Tento první experiment prokázal, že bakterie nejsou pro život savců nezbytné, a dal vzniknout vědnímu oboru gnotobiologie, který se zabývá odchovem zvířat v bezmikrobních a mikrobně definovaných podmínkách.

Po prvních krátkodobých pokusech, kdy vědci v bezmikrobním prostředí udrželi mouchy, kozu či kuřata, trvalo ještě půl století, než se gnotobiologie etablovala jako věda schopná dlouhodobě a reprodukovatelně odchovávat bezmikrobní zvířata, především hlodavce. První bezmikrobní kolonie myší a potkanů vznikly až v roce 1946, poté co byly vyřešeny problémy s krmením a izolátorovým odchovem mláďat. Podařilo se je udržet naživu až do dospělosti, kdy se začala sama rozmnožovat. Mezi průkopníky gnotobiologie patřila Lundská univerzita ve Švédsku, Laboratoř bakteriologie na Univerzitě Notre Dame (LOBUND) v USA a gnotobiotické centrum na Lékařské fakultě Nagojské univerzity v Japonsku, kterou založil Masasumi Miyakawa (česká transkripce Masasumi Mijakawa).

Jedním z nejstarších pracovišť na světě a jediné pracoviště v České republice schopné dlouhodobě odchovávat bezmikrobní zvířata je Laboratoř gnotobiologie Mikrobiologického ústavu Akademie věd ČR v Novém Hrádku v Orlických horách, kterou v šedesátých letech 20. století založil přední český imunolog Jaroslav Šterzl. V bezmikrobních podmínkách zde chovali prasata, králíky, potkany a myši. V současné době pracujeme se dvěma bezmikrobními experimentálními zvířecími modely myši a prasete, které nám umožňují studovat vliv střevních bakterií a definovaných složek mikrobioty na vývoj fyziologické a imunitní odpovědi v modelech lidských onemocnění. Myši jsou v bezmikrobních podmínkách odchovávány dlouhodobě a v současné době představují klíčový biomedicínský model pro stanovení kauzálního vztahu mezi změnami v mikrobiomu a rozvojem nemocí. Prasata jsou ideálním zvířecím modelem pro studium lidského zdraví a nemocí, protože jejich anatomie a fyziologie jsou podobné lidským. Navíc mají, na rozdíl od myší či lidí, speciální placentaci, která nedovoluje prostup mateřských imunitních buněk a protilátek – bezmikrobní selata jsou tak ideálním modelem pro studium vývoje imunitní odpovědi.

Mikrobiom a růst

Růst v juvenilním období jedince je podmíněn příjmem živin a produkcí růstových hormonů organismu. U savců je růst po narození řízen činností tzv. somatotropní osy, ve které růstový hormon (GH), produkovaný hypofýzou, stimuluje játra a další orgány k tvorbě inzulinu podobného růstového faktoru 1 (IGF-1), který stimuluje nejen růst jednotlivých orgánů, ale také růst systémový. Většina IGF-1 v krvi je produkována v játrech a váže se na proteiny krevní plazmy, zejména IGFBP-3, který prodlužuje jeho účinek. Faktor IGF-1 produkovaný přímo v tkáních, jako jsou svaly a chrupavky, se naopak uplatňuje lokálně. Pokud je organismus vystaven nedostatku potravy nebo živin, růst se zpomaluje, protože játra a tkáně přestanou na růstový hormon (GH) reagovat. To vede ke snížení produkce IGF-1, což paradoxně zvyšuje hladinu růstového hormonu v krvi, aniž by docházelo k růstu. Dochází k jevu, který je pojmenován jako rezistence k růstovému hormonu (podobně jako při cukrovce II. typu dochází k rezistenci k inzulinu – v krvi jsou hladiny inzulinu vyšší, ale buňky na něj nereagují). Chronická podvýživa způsobuje menší růst a tělesnou hmotnost a má také negativní dopad na kognitivní vývoj.

Ale jakou roli hraje v růstu mikrobiom? Když jsme porovnali růst myší konvenčních (běžný střevní mikrobiom) a myší axenických (bez jakýchkoli živých bakterií ve střevě), které dostávaly shodnou stravu obsahující všechny potřebné živiny v dostatečném množství, tak konvenční myši rostly rychleji a jejich konečná hmotnost a délka byly vyšší ve srovnání s myšmi bezmikrobními. Tento pozorovaný rozdíl nebyl způsoben většími tukovými zásobami, ale celkově větší hmotností a větším růstem vnitřních orgánů. Přítomnost střevní mikrobioty zlepšila funkci somatotropní osy a zvedla hladinu IGF-1 v séru konvenčních myší. Pokud jsme u těchto myší navodili podmínky chronické podvýživy stravou chudou na bílkoviny, tuky a vitamíny, bezmikrobní mladé myši přestaly růst do délky a přibývat na váze – jejich růst se úplně zastavil. Podvyživené konvenční myši pokračovaly v růstu, i když pomaleji než konvenční myši krmené běžnou plnohodnotnou potravou – a opět jsme pozorovali, že střevní mikrobiota zlepšila fungování somatotropní osy, což bylo doprovázeno vyššími hladinami IGF-1 a IGFBP-3 v séru. Střevní mikrobiom tak hraje zásadní roli při optimalizaci růstu za normálních podmínek a zlepšuje růst za podmínek chronické podvýživy.

Bakterie Lactiplantibacillus plantarum

Lactiplantibacillus (L.) plantarum patří mezi grampozitivní bakterie mléčného kvašení. Díky jejich adaptabilitě se jim někdy přezdívá „nomádi“, můžeme je nalézt ve velmi variabilních biotopech, jako jsou zelenina, půda a mléčně kvašené potraviny, ale také v zažívacím traktu bezobratlých a obratlovců, včetně octomilek, myší a lidí. Tým, který vede François Leulier z francouzské ENS Lyon, v roce 2011 popsal, že bezmikrobní larvy mouchy octomilky, jsou-li vystaveny chronické podvýživě snížením množství proteinů v živném médiu, rostou pomaleji a trvá jim déle, než se zakuklí. Pokud však byly larvy kolonizovány vybraným kmenem L. plantarum WJL, který se běžně vyskytuje ve střevech larev i dospělých octomilek, jejich vývoj se urychlil a zakuklily se o několik dní dříve oproti larvám bezmikrobním. Současně Leulier popsal, že schopnost zrychlit růst a vývoj mušího hostitele se u různých kmenů bakterie L. plantarum lišil – některé kmeny růst larev nebyly schopné zlepšit [2].

Mohla by tedy tato bakterie zlepšit také růst savčího podvyživeného hostitele? Abychom to zjistili, bezmikrobní myši jsme monokolonizovali kmenem L. plantarum WJL (který podporoval růst v muším modelu). Další skupinu myší jsme osadili kmenem L. plantarum NIZO2877, který v muším modelu růst nepodporoval. Myším jsme podali experimentální chudou stravu a sledovali kinetiku jejich růstu. Myši kolonizované kmenem L. plantarum WJL rostly a na konci pokusu vážily a měřily stejně jako konvenční myši na této dietě. Naproti tomu myši s kmenem L. plantarum NIZO2877 rostly mnohem méně. L. plantarum WJL také dokázal zlepšit funkci somatotropní osy, a to do stejné míry, jako jsme pozorovali u konvenčních myší, kdežto myši osazené bakterií L. plantarum NIZO2877 se v tomto ohledu více podobaly podvyživeným myším bezmikrobním, které vůbec nerostly. Kolonizace podvyživených bezmikrobních myší vybraným kmenem bakterie L. plantarum (L. plantarum WJL) se tedy ukázala jako dostatečná ke zlepšení činnosti somatotropní osy a podpory juvenilního růstu [3].

Gnotobiologie nám pomohla prokázat, že bakterie podporující růst v modelu podvýživy u larev mouchy octomilky mohou podporovat růst i u podvyživených bezmikrobních savčích mláďat. Byla by ale tato bakterie při pravidelném podávání schopna zlepšit růst podvyživených konvenčních mláďat? A jsme schopni odhalit mechanismus, jak to dělá? V našem experimentu jsme začali podvyživeným konvenčním myším 5× týdně podávat suspenzi obsahující 2 × 10⁸ bakteriálních buněk L. plantarum WJL. Rostly lépe než skupina myší, která dostávala placebo. Podávání bakterie zmírnilo zakrslost a zlepšilo fungování somatotropní osy, což se projevilo zvýšenou cirkulující hladinou a aktivitou prorůstových hormonů IGF-1 a inzulinu. Podařilo se nám také zjistit, že podávání mrtvé bakterie nebo pouze buněčné stěny izolované z bakterie L. plantarum WJL je dostatečný stimul pro zvýšení hormonu IGF-1 v krvi a zlepšený růst. Tento poznatek nám naznačil, že pravděpodobně dochází k rozpoznávání specifického motivu v buněčné stěně bakterie, a tato molekulární komunikace mezi bakterií a hostitelským organismem by mohla stát za pozorovaným zlepšeným růstem. Sérií pokusů jsme zjistili, že vnitrobuněčný receptor NOD2 je schopný rozpoznávat motiv obsažený v buněčné stěně grampozitivních bakterií. Pro zlepšení růstu byla nutná přítomnost receptoru NOD2 v buňkách střevního epitelu; po jeho stimulaci došlo ke zlepšení dělení kmenových buněk ve střevních kryptách, indukci genů regulovaných interferonem typu I, produkci IGF-1 a podpoře postnatálního růstu podvyživených konvenčních zvířat [4].

A co dál?

Naše dosud nepublikované výsledky ukazují, že L. plantarum není jediný bakteriální druh schopný podporovat růst v myším modelu podvýživy, tuto vlastnost mají i jiné bakteriální rody. Zajímavé je, že i u těchto bakterií existuje kmenová specificita – některé bakterie stejného druhu růst podporují a jiné ne –, což nám ukazuje směr našeho dalšího výzkumu. Dále probíhají pokusy na gnotobiotických selatech, které by mohly prokázat, zda L. plantarum WJL dokáže podporovat růst i v tomto modelu, fyziologicky velmi blízkém člověku. Už nyní ale naše výsledky naznačují, že v kombinaci s nutričními strategiemi by suplementace probiotiky s ověřeným účinkem, jako je L. plantarum WJL, nebo definovanými postbiotiky odvozenými z bakterií, jako jsou buněčné stěny nebo agonisté NOD2, mohla pomoci zmírnit poruchy růstu – dlouhodobý důsledek podvýživy, který stále postihuje více než 149 milionů dětí ve věku do pěti let v zemích s nízkými a středními příjmy.