Aktuální číslo:

2018/2

Téma měsíce:

Bionika

Produkce histon deacetylas v suspenzní kultuře HEK293T a jejich charakterizace

9. 6. 2016
 |  Vesmír 95, 369, 2016/6
komerční prezentace

Acetylace je jednou z nejvýznamnějších posttranslačních modifikací, srovnatelná s lépe studovanou fosforylací. Acetylace moduluje funkci tisíců proteinů, a tím ovlivňuje celou řadu buněčných procesů. Histon deacetylasy jsou třídou enzymů, která katalyzuje hydrolýzu acetylové skupiny navázané na postranním řetězci lysinu, čímž regulují úroveň acetylace svých proteinových substrátů. Lidská histon deacetylasa 6 (HDAC6) je unikátní svou lokalizací v cytoplazmě, dvěmi katalytickými doménami a substrátovou specifitou. Deacetylací svého přirozeného substrátu, tubulinu, ovlivňuje cytoskelet a v důsledku hraje významnou roli v některých neurologických onemocněních.

Rekombinantní exprese a purifikace je nedílnou součástí charakterizace proteinů a objasnění jejich funkce. Naše laboratoř využívá high-throughput metodologii pro expresi rekombinantních proteinů v různých heterologních systémech od bakteriálních (E. coli), přes kvasinkové (K. lactis), hmyzí buňky a v neposlední řadě savčí buněčné linie (HEK293T). Se zvyšující se komplexitou cílového proteinu se zvyšují nároky na expresní systém, jako jsou schopnost posttranslačních modifikací a správného sbalení proteinu. HDAC6 má složitou multidoménovou strukturu, vedle dvou katalytických domén je složen ze dvou domén zajišťujících jeho export z jádra a setrvání v cytoplazmě a dále domény vážící ubikvitin. Izolované zkrácené části molekuly HDAC6 (například pouze katalytické domény) lze s úspěchem exprimovat v K. lactis. Naproti tomu kompletní HDAC6 (ale i další histon deacetylasy) vykazující deacetylasovou aktivitu a nativní prostorovou strukturu produkujeme téměř výlučně v expresním systému HEK293T. Velkoobjemová kultivace těchto buněk je náročná z hlediska zamezení bakteriálních nebo kvasinkových kontaminací a nutnosti kultivace v atmosféře 5% CO2 se současným třepáním kvůli aeraci velkého objemu média. Rekombinantní proteiny chromatograficky purifikujeme z buněčných lyzátů a dále charakterizujeme pomocí širokého spektra biofyzikálních a enzymologických metod. Biologická relevance takto naměřených charakteristik lidské histon deacetylasy 6, izolované z lidské buněčné linie se všemi doménami, je výrazně vyšší než v případě použití rekombinantního proteinu vyprodukovaného v jednodušších expresních systémech.

New BrunswickTM S41i

Tento CO2 inkubátor – třepačka je přístroj navržený speciálně pro produkci neadherentních buněčných kultur. Kombinace pokročilého CO2 inkubátoru a vestavěné třepačky s rovnoměrným pohybem bez vibrací vytváří vysoce stabilní prostředí pro spolehlivý růst rostlinných, savčích a také hmyzích buněk.

www.eppendorf.cz

Zastoupení: Eppendorf Czech & Slovakia s.r.o.

Voděradská 2552/16, 251 01 Říčany u Prahy, E-mail: eppendorf@eppendorf.cz

Ke stažení

OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Laboratorní technika

Doporučujeme

Návrat Široka

Návrat Široka

Pavel Pipek  |  9. 2. 2018
Zpráva, která na mě právě vyskočila na Twitteru, by asi většinu Evropanů nechala chladnou, ale mé srdce buší tak, že mám chuť okamžitě vyskočit z...
Rytíř našich vod

Rytíř našich vod

Marek Janáč  |  5. 2. 2018
Na stěně ve své kanceláři má vystavené krunýře velkých raků. Za jeho pracovní židlí v akváriu rak. V knihovně knihy o racích a v laboratoři ve...
O kvantových počítačích a šifře RSA

O kvantových počítačích a šifře RSA uzamčeno

Jiří Poš  |  5. 2. 2018
značným příslibem pro výpočetní systémy budoucnosti je rozvíjející se obor kvantových počítačů. Představují naději, že eliminují některá vážná...

Předplatným pomůžete zajistit budoucnost Vesmíru

Tištěná i elektronická
verze časopisu
Digitální archiv
od roku 1994
Speciální nabídka
pro školy a studenty

 

Objednat předplatné