Aktuální číslo:

2018/7

Téma měsíce:

Co kdyby…

Produkce histon deacetylas v suspenzní kultuře HEK293T a jejich charakterizace

9. 6. 2016
 |  Vesmír 95, 369, 2016/6
komerční prezentace

Acetylace je jednou z nejvýznamnějších posttranslačních modifikací, srovnatelná s lépe studovanou fosforylací. Acetylace moduluje funkci tisíců proteinů, a tím ovlivňuje celou řadu buněčných procesů. Histon deacetylasy jsou třídou enzymů, která katalyzuje hydrolýzu acetylové skupiny navázané na postranním řetězci lysinu, čímž regulují úroveň acetylace svých proteinových substrátů. Lidská histon deacetylasa 6 (HDAC6) je unikátní svou lokalizací v cytoplazmě, dvěmi katalytickými doménami a substrátovou specifitou. Deacetylací svého přirozeného substrátu, tubulinu, ovlivňuje cytoskelet a v důsledku hraje významnou roli v některých neurologických onemocněních.

Rekombinantní exprese a purifikace je nedílnou součástí charakterizace proteinů a objasnění jejich funkce. Naše laboratoř využívá high-throughput metodologii pro expresi rekombinantních proteinů v různých heterologních systémech od bakteriálních (E. coli), přes kvasinkové (K. lactis), hmyzí buňky a v neposlední řadě savčí buněčné linie (HEK293T). Se zvyšující se komplexitou cílového proteinu se zvyšují nároky na expresní systém, jako jsou schopnost posttranslačních modifikací a správného sbalení proteinu. HDAC6 má složitou multidoménovou strukturu, vedle dvou katalytických domén je složen ze dvou domén zajišťujících jeho export z jádra a setrvání v cytoplazmě a dále domény vážící ubikvitin. Izolované zkrácené části molekuly HDAC6 (například pouze katalytické domény) lze s úspěchem exprimovat v K. lactis. Naproti tomu kompletní HDAC6 (ale i další histon deacetylasy) vykazující deacetylasovou aktivitu a nativní prostorovou strukturu produkujeme téměř výlučně v expresním systému HEK293T. Velkoobjemová kultivace těchto buněk je náročná z hlediska zamezení bakteriálních nebo kvasinkových kontaminací a nutnosti kultivace v atmosféře 5% CO2 se současným třepáním kvůli aeraci velkého objemu média. Rekombinantní proteiny chromatograficky purifikujeme z buněčných lyzátů a dále charakterizujeme pomocí širokého spektra biofyzikálních a enzymologických metod. Biologická relevance takto naměřených charakteristik lidské histon deacetylasy 6, izolované z lidské buněčné linie se všemi doménami, je výrazně vyšší než v případě použití rekombinantního proteinu vyprodukovaného v jednodušších expresních systémech.

New BrunswickTM S41i

Tento CO2 inkubátor – třepačka je přístroj navržený speciálně pro produkci neadherentních buněčných kultur. Kombinace pokročilého CO2 inkubátoru a vestavěné třepačky s rovnoměrným pohybem bez vibrací vytváří vysoce stabilní prostředí pro spolehlivý růst rostlinných, savčích a také hmyzích buněk.

www.eppendorf.cz

Zastoupení: Eppendorf Czech & Slovakia s.r.o.

Voděradská 2552/16, 251 01 Říčany u Prahy, E-mail: eppendorf@eppendorf.cz

Ke stažení

OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Laboratorní technika

Doporučujeme

Člověk páchne *alkoholem

Člověk páchne *alkoholem audio

Jaroslav Petr  |  5. 8. 2018
Že pach lidského těla „vyrábějí“ bakterie, se ví už relativně dlouho. Některé mechanismy tohoto procesu jsou ale dosud stále tajemstvím. Britští...
Do světa a zase zpět

Do světa a zase zpět

Eva Bobůrková  |  31. 7. 2018
Mladý lékař Karel Kieslich o sobě říká: „Splňuji archetyp českého Honzy“. Studuje totiž na University College v Londýně, chtěl by ve světě...
Zahalená Venuše

Zahalená Venuše uzamčeno

Jan Veselý  |  16. 7. 2018
Snímky pořízené ve viditelném a infračerveném oboru kamerou VIRTIS sondy Venus Express zachycují pozoruhodná oblaka v nejvyšších vrstvách...

Předplatným pomůžete zajistit budoucnost Vesmíru

Tištěná i elektronická
verze časopisu
Digitální archiv
od roku 1994
Speciální nabídka
pro školy a studenty

 

Objednat předplatné