Siemens2025Siemens2025Siemens2025Siemens2025Siemens2025Siemens2025

Aktuální číslo:

2025/10

Téma měsíce:

(Ne)pozornost

Obálka čísla

Produkce histon deacetylas v suspenzní kultuře HEK293T a jejich charakterizace

9. 6. 2016
 |  Vesmír 95, 369, 2016/6
komerční prezentace

Acetylace je jednou z nejvýznamnějších posttranslačních modifikací, srovnatelná s lépe studovanou fosforylací. Acetylace moduluje funkci tisíců proteinů, a tím ovlivňuje celou řadu buněčných procesů. Histon deacetylasy jsou třídou enzymů, která katalyzuje hydrolýzu acetylové skupiny navázané na postranním řetězci lysinu, čímž regulují úroveň acetylace svých proteinových substrátů. Lidská histon deacetylasa 6 (HDAC6) je unikátní svou lokalizací v cytoplazmě, dvěmi katalytickými doménami a substrátovou specifitou. Deacetylací svého přirozeného substrátu, tubulinu, ovlivňuje cytoskelet a v důsledku hraje významnou roli v některých neurologických onemocněních.

Rekombinantní exprese a purifikace je nedílnou součástí charakterizace proteinů a objasnění jejich funkce. Naše laboratoř využívá high-throughput metodologii pro expresi rekombinantních proteinů v různých heterologních systémech od bakteriálních (E. coli), přes kvasinkové (K. lactis), hmyzí buňky a v neposlední řadě savčí buněčné linie (HEK293T). Se zvyšující se komplexitou cílového proteinu se zvyšují nároky na expresní systém, jako jsou schopnost posttranslačních modifikací a správného sbalení proteinu. HDAC6 má složitou multidoménovou strukturu, vedle dvou katalytických domén je složen ze dvou domén zajišťujících jeho export z jádra a setrvání v cytoplazmě a dále domény vážící ubikvitin. Izolované zkrácené části molekuly HDAC6 (například pouze katalytické domény) lze s úspěchem exprimovat v K. lactis. Naproti tomu kompletní HDAC6 (ale i další histon deacetylasy) vykazující deacetylasovou aktivitu a nativní prostorovou strukturu produkujeme téměř výlučně v expresním systému HEK293T. Velkoobjemová kultivace těchto buněk je náročná z hlediska zamezení bakteriálních nebo kvasinkových kontaminací a nutnosti kultivace v atmosféře 5% CO2 se současným třepáním kvůli aeraci velkého objemu média. Rekombinantní proteiny chromatograficky purifikujeme z buněčných lyzátů a dále charakterizujeme pomocí širokého spektra biofyzikálních a enzymologických metod. Biologická relevance takto naměřených charakteristik lidské histon deacetylasy 6, izolované z lidské buněčné linie se všemi doménami, je výrazně vyšší než v případě použití rekombinantního proteinu vyprodukovaného v jednodušších expresních systémech.

New BrunswickTM S41i

Tento CO2 inkubátor – třepačka je přístroj navržený speciálně pro produkci neadherentních buněčných kultur. Kombinace pokročilého CO2 inkubátoru a vestavěné třepačky s rovnoměrným pohybem bez vibrací vytváří vysoce stabilní prostředí pro spolehlivý růst rostlinných, savčích a také hmyzích buněk.

www.eppendorf.cz

Zastoupení: Eppendorf Czech & Slovakia s.r.o.

Voděradská 2552/16, 251 01 Říčany u Prahy, E-mail: eppendorf@eppendorf.cz

Ke stažení

OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Laboratorní technika

Doporučujeme

Zadání testu z titulní strany

Zadání testu z titulní strany

Petr Telenský  |  29. 9. 2025
Na titulní straně říjnového Vesmíru jsme otiskli Bourdonův test setrvalé pozornosti, známý také jako Bourdonův-Wiersmův test. Jde o tradiční...
Vypravěč velkých příběhů

Vypravěč velkých příběhů

Ondřej Vrtiška  |  29. 9. 2025
Je Jan Černý spíše imunolog, nebo buněčný biolog? Sám o sobě raději mluví obecněji jako o přírodovědci, do menších škatulek se nevejde. Stejně...
Když dva vidí totéž, není to vždy totéž

Když dva vidí totéž, není to vždy totéž uzamčeno

Petr Telenský  |  29. 9. 2025
Slavný citát, připisovaný polskému básníkovi Stanislawu Jerzy Lecovi a zhudebněný Ivo Jahelkou, říká, že seno voní jinak koním a jinak...