Produkce histon deacetylas v suspenzní kultuře HEK293T a jejich charakterizace

Acetylace je jednou z nejvýznamnějších posttranslačních modifikací, srovnatelná s lépe studovanou fosforylací. Acetylace moduluje funkci tisíců proteinů, a tím ovlivňuje celou řadu buněčných procesů. Histon deacetylasy jsou třídou enzymů, která katalyzuje hydrolýzu acetylové skupiny navázané na postranním řetězci lysinu, čímž regulují úroveň acetylace svých proteinových substrátů. Lidská histon deacetylasa 6 (HDAC6) je unikátní svou lokalizací v cytoplazmě, dvěmi katalytickými doménami a substrátovou specifitou. Deacetylací svého přirozeného substrátu, tubulinu, ovlivňuje cytoskelet a v důsledku hraje významnou roli v některých neurologických onemocněních.

Rekombinantní exprese a purifikace je nedílnou součástí charakterizace proteinů a objasnění jejich funkce. Naše laboratoř využívá high-throughput metodologii pro expresi rekombinantních proteinů v různých heterologních systémech od bakteriálních (E. coli), přes kvasinkové (K. lactis), hmyzí buňky a v neposlední řadě savčí buněčné linie (HEK293T). Se zvyšující se komplexitou cílového proteinu se zvyšují nároky na expresní systém, jako jsou schopnost posttranslačních modifikací a správného sbalení proteinu. HDAC6 má složitou multidoménovou strukturu, vedle dvou katalytických domén je složen ze dvou domén zajišťujících jeho export z jádra a setrvání v cytoplazmě a dále domény vážící ubikvitin. Izolované zkrácené části molekuly HDAC6 (například pouze katalytické domény) lze s úspěchem exprimovat v K. lactis. Naproti tomu kompletní HDAC6 (ale i další histon deacetylasy) vykazující deacetylasovou aktivitu a nativní prostorovou strukturu produkujeme téměř výlučně v expresním systému HEK293T. Velkoobjemová kultivace těchto buněk je náročná z hlediska zamezení bakteriálních nebo kvasinkových kontaminací a nutnosti kultivace v atmosféře 5% CO₂ se současným třepáním kvůli aeraci velkého objemu média. Rekombinantní proteiny chromatograficky purifikujeme z buněčných lyzátů a dále charakterizujeme pomocí širokého spektra biofyzikálních a enzymologických metod. Biologická relevance takto naměřených charakteristik lidské histon deacetylasy 6, izolované z lidské buněčné linie se všemi doménami, je výrazně vyšší než v případě použití rekombinantního proteinu vyprodukovaného v jednodušších expresních systémech.