Vesmírná škola 2Vesmírná škola 2Vesmírná škola 2Vesmírná škola 2Vesmírná škola 2Vesmírná škola 2

Aktuální číslo:

2024/12

Téma měsíce:

Expedice

Obálka čísla

Produkce histon deacetylas v suspenzní kultuře HEK293T a jejich charakterizace

9. 6. 2016
 |  Vesmír 95, 369, 2016/6
komerční prezentace

Acetylace je jednou z nejvýznamnějších posttranslačních modifikací, srovnatelná s lépe studovanou fosforylací. Acetylace moduluje funkci tisíců proteinů, a tím ovlivňuje celou řadu buněčných procesů. Histon deacetylasy jsou třídou enzymů, která katalyzuje hydrolýzu acetylové skupiny navázané na postranním řetězci lysinu, čímž regulují úroveň acetylace svých proteinových substrátů. Lidská histon deacetylasa 6 (HDAC6) je unikátní svou lokalizací v cytoplazmě, dvěmi katalytickými doménami a substrátovou specifitou. Deacetylací svého přirozeného substrátu, tubulinu, ovlivňuje cytoskelet a v důsledku hraje významnou roli v některých neurologických onemocněních.

Rekombinantní exprese a purifikace je nedílnou součástí charakterizace proteinů a objasnění jejich funkce. Naše laboratoř využívá high-throughput metodologii pro expresi rekombinantních proteinů v různých heterologních systémech od bakteriálních (E. coli), přes kvasinkové (K. lactis), hmyzí buňky a v neposlední řadě savčí buněčné linie (HEK293T). Se zvyšující se komplexitou cílového proteinu se zvyšují nároky na expresní systém, jako jsou schopnost posttranslačních modifikací a správného sbalení proteinu. HDAC6 má složitou multidoménovou strukturu, vedle dvou katalytických domén je složen ze dvou domén zajišťujících jeho export z jádra a setrvání v cytoplazmě a dále domény vážící ubikvitin. Izolované zkrácené části molekuly HDAC6 (například pouze katalytické domény) lze s úspěchem exprimovat v K. lactis. Naproti tomu kompletní HDAC6 (ale i další histon deacetylasy) vykazující deacetylasovou aktivitu a nativní prostorovou strukturu produkujeme téměř výlučně v expresním systému HEK293T. Velkoobjemová kultivace těchto buněk je náročná z hlediska zamezení bakteriálních nebo kvasinkových kontaminací a nutnosti kultivace v atmosféře 5% CO2 se současným třepáním kvůli aeraci velkého objemu média. Rekombinantní proteiny chromatograficky purifikujeme z buněčných lyzátů a dále charakterizujeme pomocí širokého spektra biofyzikálních a enzymologických metod. Biologická relevance takto naměřených charakteristik lidské histon deacetylasy 6, izolované z lidské buněčné linie se všemi doménami, je výrazně vyšší než v případě použití rekombinantního proteinu vyprodukovaného v jednodušších expresních systémech.

New BrunswickTM S41i

Tento CO2 inkubátor – třepačka je přístroj navržený speciálně pro produkci neadherentních buněčných kultur. Kombinace pokročilého CO2 inkubátoru a vestavěné třepačky s rovnoměrným pohybem bez vibrací vytváří vysoce stabilní prostředí pro spolehlivý růst rostlinných, savčích a také hmyzích buněk.

www.eppendorf.cz

Zastoupení: Eppendorf Czech & Slovakia s.r.o.

Voděradská 2552/16, 251 01 Říčany u Prahy, E-mail: eppendorf@eppendorf.cz

Ke stažení

OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Laboratorní technika

Doporučujeme

Do srdce temnoty

Do srdce temnoty uzamčeno

Ladislav Varadzin, Petr Pokorný  |  2. 12. 2024
Archeologické expedice do severní Afriky tradičně směřovaly k bývalým či stávajícím řekám a jezerům, což téměř dokonale odvádělo pozornost od...
Vzhůru na tropický ostrov

Vzhůru na tropický ostrov

Vojtěch Novotný  |  2. 12. 2024
Výpravy na Novou Guineu mohou mít velmi rozličnou podobu. Někdo zakládá osadu nahých milovníků slunce, jiný slibuje nový ráj na Zemi, objevuje...
Je na obzoru fit pilulka?

Je na obzoru fit pilulka? uzamčeno

Stanislav Rádl  |  2. 12. 2024
U řady onemocnění se nám kromě příslušné medikace od lékaře dostane také doporučení zvýšit svoji fyzickou aktivitu. Lze ji nahradit „zázračnou...