Srdeční inženýrství

Autoři nedávné experimentální studie ¹⁾ hned v prvních odstavcích uvádějí, že jen v samotných Spojených státech je ročně registrováno 3000 osob čekajících na mozkovou smrt někoho jiného, aby jejich vlastní život mohl být zachráněn transplantací srdce. Na celém světě (alespoň v zemích, kde se vedou tyto statistiky) žije 22 milionů lidí se selhávajícím srdcem. Ti všichni stojí v pomyslné dlouhé řadě potenciálních příjemců tohoto orgánu od jiných osob. Řada z nich bohužel toto čekání nepřežije, protože orgánů je nedostatek.

Poptávka po „biologickém materiálu“

Transplantace jsou nejen záchranou pro pacienty, ale v některých zemích se stávají děsivým byznysem. Obchod s orgány kvete v Indii, poplašné zprávy však přicházejí především z Číny. Tam jsou údajně používány orgány nejen obětí úrazů a popravených zločinců, ale i nevinných mladých a zdravě žijících členů některých buddhistických skupin, ²⁾ kteří mizí za zdmi věznic a oblastních, především vojenských nemocnic. Sem pak přijíždějí bohatí západní pacienti, kteří prý do měsíce bez problému najdou v Číně svého „dárce“.

Rostoucí poptávka po „biologickém materiálu“ (včetně krve a jejích složek), provázená pochybnými obchody, zvyšuje význam výzkumu a zavádění jiných způsobů, jimiž lze selhávající orgány nahradit nebo opravit. ³⁾ Dnes se samozřejmě v tomto kontextu uvádějí především kmenové buňky buď od pacientů (autologní), nebo od jiného jedince (heterologní). Zatím jsou použitelné jen náhrady několika poměrně jednoduchých tkání, jako je kůže (u popálenin a v kosmetice), chrupavka u artrózy nebo kostní dřeň u některých typů leukemie. Ani v těchto případech nejsou problémy s odvržením transplantovaných tkání od jiné osoby či s přenosem virových onemocnění stoprocentně vyřešeny.

Někdy mohou být alternativou k transplantaci srdce biomechanické stažitelné kroužky svaloviny, vhodné především na podporu namáhané levé srdeční komory, která pumpuje krev do celého těla. Preklinické experimenty dávají jistou naději na uplatnění endotelových a mezenchymálních kmenových buněk při regeneraci svaloviny v místě infarktu ⁴⁾ a v poslední době se úspěšně daří osídlit kmenovými nebo zárodečnými buňkami kolagenové kostřičky kousků různých orgánů. Říkáme tomu biologizace tkáňových transplantátů. Například epitelové buňky štítné žlázy vytvářejí sekreční váčky (folikuly) a ledvinové i mléčné epitelové buňky se na kolagenu organizují podobně jako ve vlastních orgánech.

Fascinující a nadějnou vlastností izolovaných novorozených srdečních buněk je vrozená schopnost dělit se a shlukovat na dně inkubačních mističek do jednobuněčných či vícebuněčných vrstev a elektricky se propojovat.

Je „biologický materiál“ jediným řešením?

Když jsme v osmdesátých letech v naší laboratoři v Krči poprvé pozorovali několikadenní kulturu myších kardiocytů, jak se synchronně stahují na dně Petriho misky, byli jsme u vytržení. A co teprve když byly pravidelné záškuby provázeny fluorescenčními záblesky při vstupu vápníku do buněk otevřenými vápníkovými kanály! Tato krása ale netrvala dlouho. Za pár hodin se celá vrstvička ze dna odloupla, chvíli plavala jako umělá světélkující medúza, a pak odumřela. Něco jí chybělo ke štěstí a k dalšímu funkčnímu přežití. Ukázalo se, že těch „něco“ je povícero. Především chyběly podpůrná tkáň, kolagen a mezibuněčný laminin. Jakmile jsme pokryli dno misek kolagenem (typu I nebo IV), popřípadě umělým polylyzinem nebo fibroblasty, které kolagen produkují, kardio cyty přežívaly mnohem déle. Lze připravit i stahující se sendvič z vrstev kolagenu (fibroblastů) a kardiocytů.

Taková srdeční tkáň ale potřebuje mnoho dalších faktorů. Jsou nutné výstelkové endotelové buňky, které usnadňují jejich dělení a dospívání, buňky hladké svaloviny, a dokonce některé bílé krvinky a látky, které produkují (růstové faktory a cytokiny). Zároveň musí rostoucí srdeční tkáň vykonávat práci, buňky chtějí být zatíženy. Skutečně zde platí, že „práce šlechtí“. Proto se v laboratořích konstruují různé počítačem řízené mechanické a magnetické stroječky na trvalé či rytmické napínání srdeční tkáně nebo se rostoucí soubuní (syncytium) elektricky dráždí, bez práce by bídně zahynulo.

Jestliže vytvoříme srdeční záplatu tlustší než 0,2 mm, nastane problém se zásobením vnitřních vrstev sendviče kyslíkem a živinami. Difuze už nestačí a prorůstání vlásečnic je vcelku bezcenné, protože do nich v misce žádná krev neteče. Je tedy jasné, že vypěstovat použitelnou trojrozměrnou tkáň představuje tvrdý oříšek. Nejdůležitější ze všeho ale je vytvořit to správné mezibuněčné „lešení“ nebo „betonářské bednění“, což je u tak tvarově i funkčně složitého orgánu, jakým je savčí srdce, téměř nadlidský úkol.

Srdce zbavené buněk

Jistý pokrok v biologizaci malých kousků tkáně podnítily skupinu Doris Taylorové z Centra pro opravy kardiovaskulárního systému Massachusettské všeobecné nemocnice a Lékařské fakulty Harvardovy univerzity, aby se pokusili buňkami novorozených mláďat osídlit kolagenovou kostru celého srdce i s krevním zásobením z dospělého laboratorního potkana. Předešleme, že srdce ve fyziologickém experimentu má jednu velkou výhodu. Můžeme ho vyjmout z těla, zavěsit do bioinkubátoru a promývat sterilním výživným fyziologickým roztokem pomocí plastových trubiček. Tak lze srdce, do nějž se navíc dodávají antibiotika, po hodiny a dny udržovat v slušném funkčním stavu. Okysličený a zahřátý fyziologický roztok se pod mírným tlakem zavádí zpětným chodem přes aortu. Srdce je tak zásobeno zpětným plněním síní a komor, a především přirozenou cestou, věnčitými tepnami. Řada elektrod a tenzometrů může měřit jeho spontánní elektrickou aktivitu a stav dráždivosti, srdeční sílu, práci a výkon. Takto připravenému srdci říkáme Langerdorffův preparát a v jednoduchém provedení ho znají z fyziologických praktik medici, farmakologové a biologové. Když jsme s J. Slavíčkem z 1. lékařské fakulty před lety studovali na podobných preparátech uvolňování draslíku iontově-selektivními elektrodami, zkoušeli jsme srdeční sval zbavit kolagenu pomocí enzymu kolagenázy, abychom zlepšili kontakt elektrod s živými kardiocyty. ⁵⁾

D. Taylorová a její kolegové postupovali obráceně. Nejprve izolované srdce zbavili kardiocytů a epitelových buněk ve stěnách komor, síní a cév tak, aby zbyl pouze pružný, tvarově nezměněný nebuněčný skelet. ⁶⁾

Po takovém vymytí byla nyní již bledá a téměř průsvitná srdce několik dnů promývána sterilním výživným fyziologickým roztokem a testovaly se mechanické vlastnosti jejich stěn. Nakonec pracovníci u každého srdce zavedli kanylu do levé předsíně a sestupné aorty, všili stimulační elektrody a zapojili průtokoměr. Nyní nastal závažný okamžik – do uzavřeného koronárního oběhu postupně injikovali v několika dávkách suspenzi asi 50 milionů neonatálních enzymaticky a mechanicky rozvlákněných srdečních kardiocytů, fibroblastů, výstelkových buněk a buněk hladké svaloviny.

Tyto embryonální buňky během dalších osm dnů osídlily uprázdněné prostory srdce. Už čtvrtý den začaly spontánní prstencovité stahy (kontrakce), které se později synchronizovaly v slabý stah celého srdce pomocí umělé stimulace. Histologická vyšetření ukázala přítomnost buněčných elementů velmi podobných kardiocytům. Buňky měly stažlivé bílkoviny, např. alfa-aktin, a typ těžkého myozinového řetězce, který je pro srdce charakteristický. Ve věnčitých cévách byly nalezeny nově vzniklé jednovrstevné epitely s vlastnostmi typickými pro výstelku, jako je schopnost metabolizovat fluorescenční barvivo chloromethyl fluorescein diacetát (a tedy obarvovat).

Zatím jen dvouprocentní výkonnost

Po zhruba osmi dnech zřejmě přece jen zvítězila infekce a srdíčka odumřela. Nicméně tyto první pokusy s celým srdcem zbaveným buněk a s jeho osazením stažitelnými a výstelkovými buňkami potvrzují v principu správnost této cesty. Zatím má osmidenní konstrukt výkonnost jen 2 % minutového objemu dospělého potkaního srdce a 25 % srdce šestnáctidenního mláděte. Jak vyplývá z popisu metodiky, pokusili se autoři tato nově biologizovaná srdce implantovat do těla jiného jedince a nechat je dál vyvíjet, ale výsledek ani nepopisovali, ani nekomentovali. Podle autorů je metoda použitelná i pro srdce prasete, velikostí blízkého lidskému, jehož základ zbavený buněk by se mohl možná osadit lidskými novorozeneckými buňkami. Také uvádějí, že podobně lze zbavit buněk a znovu osadit téměř všechny pevné tkáně, jmenovitě plíce, ledviny, játra a kosterní svaly. Přinejmenším v případě kosterních svalů lze jejich optimizmus sdílet, protože díky „rezervním“ (satelitním) buňkám, které jsou vybaveny k dělení, a díky poměrně jednoduché stavbě mají svaly slušný regenerační potenciál.

Sdělovací prostředky označily tyto nadějné pokusy téměř za senzaci, za skoro jistou a rychlou cestu k hromadnému léčení různých srdečních onemocnění. Připomeňme si ale několik z mnoha závažných problémů, které nejsou zatím vyřešeny. Nová srdeční tkáň, vznikající z kmenových nebo progenitorových buněk (to jsou ty, které jsou schopny dozrát jen v jeden typ tkáně), může být v některých svých oblastech zdrojem arytmií. ⁷⁾ Další možné riziko spočívá v tom, že asi jedna buňka z milionu se může stát zdrojem nádoru. Jsou sice metody, jak riziko vzniku nádoru po transplantaci snížit. Kmenové buňky lze vybavit nějakým genem sebevraždy, např. genem pro tymidinkinázu viru herpes, která činí nediferencované, potenciálně nádorotvorné potomky embryonálních kmenových buněk citlivými na některá léčiva, jako je virostatikum gancyklovir. Tato strategie je zatím v plenkách a žádný z takových genetických postupů není rutinně proveditelný a nemusí být ani stoprocentně účinný. Nadto jakákoliv genetická manipulace s kmenovými buňkami je nejistá kvůli jejich genetické nestabilitě a může sama vyvolat nepředvídatelné zhoubné bujení. Jistým problémem je a bude i do budoucna nedostatečné prokrvení objemnějších stěn nově upravených orgánů.

Výhledy stavitelů srdcí

Poměrně mladá oblast srdečního inženýrství včetně xenotransplantace, ⁸⁾ mechanických náhrad a buněčné terapie si bezesporu najde další cestičky do kardiologické praxe. ⁹⁾ Fascinující přirozená schopnost srdečních buněk vytvářet v tkáňových kulturách nebo srdečních stěnách zbavených buněk spontánně se stahující soubuní je a bude stále víc využívána také při testování srdečních léků a jedů in vitro. A pokud jde o opravu vlastního pacientova srdce? Zbavení buněk a opětné osazení nemocného srdce či jiných tkání se stěží stane v horizontu několika let univerzálním řešením v kardiologii. Jistá omezení jsou nasnadě. Například kolagenová kostra srdce s dilatační kardiomyopatií (degenerativním onemocněním, při kterém dochází k rozšíření srdečních dutin a zeslabení srdečních stěn) nebo aneuryzmatem (výdutí) může být sama zdeformována a asi by nemělo význam takový tvar uchovat a vystlat ho jen novou tkání. S trochou naivního entuziazmu si ale můžeme říct – kdoví, vždyť to, co bylo před deseti lety čirou fantazií např. ve výzkumu kmenových buněk, je dnes realistickým programem mnoha ústavů a klinik, s praktickými dopady.