Utajené pohledy

Většina živých organizmů vykazuje nějakou autofluorescenci. Co to znamená? Jestliže na ně posvítíme budícím, zpravidla ultrafialovým světlem, vyzáří emisní světlo jiné barvy (jeho vlnová délka je vždy delší než vlnová délka budícího světla). Toto světlo však nebylo snadné mikroskopicky přesně měřit. V současnosti dokáže laserový konfokální mikroskop Olympus Fluoview FV1000 tato emisní spektra stanovovat, a to s přesností na 2 nm (což je barevný rozdíl okem sotva postřehnutelný). Získaná spektra se dají použít pro stanovení ideálních podmínek vhodných k zobrazení zkoumané fluoreskující struktury.

Tento postup jsme uplatnili při pohledu do útrob mikroskopických larev mořských korýšů. Abychom mohli odlišit dvě fluoreskující struktury, musí se vrcholy jejich emisních spekter lišit alespoň o 5 nm. Každý vrchol emisního spektra lze odděleně zaznamenat a výslednému obrazu můžeme přiřadit zvolenou barvu. Pak provedeme řadu optických řezů zkoumaným organizmem pomocí zaostření do různých rovin. Správná volba počtu optických řezů a vzdáleností mezi nimi je velice důležitá pro závěrečnou prostorovou rekonstrukci.

Tento proces se dá automatizovat po krocích vzdálených od sebe nejméně 0,1 μm. Současně můžeme tímto způsobem snímat tři odlišná spektra pro každý optický řez. Spojením všech optických řezů do jednoho obrazu vznikne snímek obsahující tři původní barvy, které se prolínají a často vytvářejí okouzlující pohled do nitra studovaného organizmu. Navíc vznikne počítačovým součtem optických řezů všech tří spekter unikátní trojrozměrný pohled. Dřívější rekonstrukce pomocí histologických řezů byly velice pracné a u organizmů, které jsme zkoumali, téměř nemožné. Během přípravy histologického řezu se totiž vždy rozlámal tvrdý a křehký krunýř a poškodila velice jemná struktura vnitřních orgánů. Nový postup se proto brzy stane nepostradatelným zejména při studiu anatomie a fyziologie nejdrobnějších živých tvorů. Jestliže použijeme některý z postupů pro fluorescenční značení genů (např. vložením genu pro zeleně fluoreskující protein), můžeme studovat funkce bílkovin, které tyto geny kódují.