Vstupenka do „Země věčného mládí“

Tir nan Og neboli „Zemi věčného mládí“ najdeme v keltské mytologii. Nejen Keltové však o této možnosti snili. Elixír života a elixír věčného mládí byly vedle homunkula nebo výroby zlata hlavními přísliby, na kterých založil své živobytí nejeden alchymista. Teprve ve 20. století se sny alchymistů začaly naplňovat. Jaderná chemie a fyzika ukázaly, že transmutace prvků, a tedy i výroba zlata z méně ušlechtilých kovů, je principiálně možná, i když nepřiměřeně drahá. Jednadvacáté století začíná hledáním „elixíru mládí“, tentokrát spojenými silami buněčných a molekulárních biologů, s využitím technik genového inženýrství. Pozornost se zaměřuje na buňky pocházející z mnohobuněčných organizmů, hlavně na ty, které buď mají schopnost dát vznik specializovaným, diferencovaným a dále se již nemnožícím buňkám, anebo se mohou dělit víceméně neomezeně. Tyto kmenové buňky v současné době fascinují vědecký svět i laickou veřejnost.

Klasifikace kmenových buněk a jejich odlišnost od buněk diferencovaných

Kmenové buňky rozhodují o normálním růstu a vývoji zvířat i lidí. Růst, vývoj a udržování jednotlivých tkání a orgánů vyžadují, aby se buňky obnovovaly procesem buněčného dělení, což dokážou buňky kmenové, ale ne buňky diferencované, např. buňky krevní nebo svalové. Kmenové buňky tudíž zajišťují svým dělením i přísun nových buněk do tkání, jako jsou např. kůže, žaludek, střevo či krev, tj. do míst, kde je stálá výměna buněk. Zásobují však i svaly, popřípadě další tkáně, kde se buňky sice pravidelně nevyměňují, ale zato se snadno opotřebovávají, nebo dokonce ničí, např. poraněním.

Kmenové buňky nemají žádné specializované fyziologické funkce. Tím se liší např. od červených krvinek, které přenášejí kyslík krevním řečištěm k cílové tkáni, od svalových buněk, zajišťujících svalovou kontrakci (tedy i pohyb), nebo od neuronů, nezbytných pro přenos nervového vzruchu. Kmenové buňky z jednotlivých tkání jsou v různých stadiích vývoje a liší se počtem typů specializovaných buněk, jimž mohou dát vznik v procesu diferenciace. Jak se organizmus vyvíjí, potenciál kmenových buněk produkovat jiné buněčné typy se postupně snižuje. Pluripotentní kmenové buňky, které mají potenciál vyvinout se v jakýkoliv typ buněk dospělého organizmu, lze nalézt v těle embrya, jež je ve velmi časných stadiích svého vývoje. Multipotentní kmenové buňky jsou schopny vyvinout jen omezený počet typů tělních buněk a lze je nalézt v dospělých jedincích.

Kmenové buňky byly úspěšně izolovány např. z myší a člověka, a to z časného embrya, plodu, placenty, pupeční šňůry a z mnoha tkání. Kmenové buňky, izolované z různých tkání v různých dobách vývoje, se liší spektrem buněčných typů, které jejich diferenciací mohou vzniknout. Buňky z časných embryonálních stadií, tzv. embryonální kmenové buňky, jsou získávány u savců z embryí 5 až 6 dní starých, která mají ještě tvar míče, ovšem o velikosti špendlíkové hlavičky, a jsou ve stadiu blastocysty. Tyto buňky jsou schopny vytvářet všechny buněčné typy, tudíž jsou pluripotentní. Tkáňové kmenové buňky byly zatím izolovány jen z některých tkání dospělých jedinců, konkrétně to jsou: kostní dřeň, krev, kůže, svaly, játra, mozek, rohovka, oční retina, výstelka střeva a pankreas. Tyto kmenové buňky obvykle produkují pouze buňky své vlastní tkáně, tzn. jen velmi omezený počet buněčných typů. Jsou to buňky multipotentní až unipotentní.

Využití kmenových buněk pro lékařské účely

Rozruch okolo kmenových buněk je pochopitelný, protože představují ideální model pro studium vývoje organizmu od oplodnění vajíčka, hledání faktorů, které kontrolují replikaci a diferenciaci buněk, a faktorů, které regulují přepnutí mezi těmito procesy.

Kmenové buňky mají navíc schopnost nahrazovat poškozené buňky tělní. Za určitých podmínek jsou kmenové buňky přeměněny např. v buňky krevní, za jiných v buňky svalové, nervové, popř. v buňky produkující inzulin. Mohou být tudíž využity i jako náhrada buněk, které byly poškozeny v souvislosti s různými nevyléčitelnými chorobami, jako jsou např. diabetes, Parkinsonova choroba či srdeční onemocnění, ale také v souvislosti s různými zraněními či chirurgickými zákroky. Při lékařských aplikacích se počítá s tím, že přenos vhodných kmenových buněk do určité poškozené tkáně povede k vývoji vhodně diferencovaných buněk, které nahradí buňky poškozené. Tyto manipulace patří do oblasti regenerativní medicíny. Vědci počítají s tím, že budou kmenové buňky pěstovány v laboratořích a směrovány k produkci buněk těch typů, které budou požadovány pro určitou transplantaci nebo pro testování různých léků. Proto je zájem mnoha laboratoří soustředěn na faktory, jež indukují přechod různých kmenových buněk na diferencované buňky určitého typu.

Hlavní problémy, jimž čelí terapie kmenovými buňkami, jsou stejné jako při transplantacích orgánů a tkání. Imunitní systém totiž může odloučit jak cizí buňky, tak tkáně či orgány. Částečně lze tento problém odstranit použitím imunosupresivních látek. Druhou možnost nabízejí zdravé kmenové buňky izolované z tkáně pacienta, která má být transplantována, pokud jsou ovšem vůbec nějaké takové buňky dostupné. Další problém může být způsoben nekontrolovaným dělením transplantovaných kmenových buněk, které by mohlo vyvolat nádorové bujení.

Etické problémy

Lidé, kterým odebrali krev, nebo dokonce kus pevné tkáně biopsií, dnes většinou nemají vážnější problémy s pomyšlením, že buňky jejich tkáně budou použity na různé účely. Na dárce krve jsme si zvykli již dávno a dárcům orgánů projevujeme vděčnost, i když často až po jejich smrti. Legislativa v této oblasti je celkem prověřená. Horší situace nastává, když jde o buňky embryonální. Velmi striktní pravidla, předpisy a zákony představují značné komplikace a výrazně brzdí v této oblasti rozvoj. Etické problémy a restrikce provázejí manipulace s embryi včetně těch, která jsou získána při potratech. Problémy jsou dokonce i s „odpadem“ (placentami či pupečními šňůrami) vznikajícím při porodech, i když v této oblasti je situace lepší. Je pravděpodobné, že zábrany budou velké i v blízké budoucnosti, a proto většina vědců souhlasí s názorem, že kromě embryonálních kmenových buněk musí paralelně probíhat i výzkum snadněji dostupných tkáňových kmenových buněk a kmenových buněk z dalších zdrojů. Možnost lékařských aplikací, při kterých kmenové buňky nahradí buňky poškozené např. nevyléčitelnou chorobou, je pro lidský rod přece jen zavazující a zpomalení nebo zastavení výzkumu kvůli etickým problémům s embryonálními buňkami by mohlo být pro mnoho postižených osudové. Na legislativě se u nás i v Evropské unii v současné době intenzivně pracuje. Je zřejmé, že využívání kmenových buněk pro lékařské a výzkumné účely bude schváleno, ale jednotlivé státy se liší dílčími omezeními. U nás prozatím schválení udílí speciální komise odborníků. Výchozí normou je Charta lidských práv a svobod. V současnosti se v řadě států toleruje práce s embryem, které vzniklo umělým oplodněním ex vivo, pokud není starší 14 dnů (nejčastěji 5–6 dnů) a pochopitelně pokud s tím souhlasí rodiče. Naštěstí se ukázalo, že tkáňové kmenové buňky z dospělých jedinců vykazují přizpůsobivost, která zvyšuje jejich terapeutický potenciál. Za vhodných podmínek lze tudíž rozšířit spektrum buněčných typů, jež se dají odvodit z jednotlivých linií tkáňových kmenových buněk. Např. kmenové buňky z krve mohou být povzbuzeny k diferenciaci na neurony. Výhodou tkáňových kmenových buněk je také to, že je lze obvykle poměrně snadno pro lékařské aplikace získat z téhož člověka, který má být transplantací léčen. Odebrané buňky se pomnoží in vitro, a pak se vrátí (popř. i nějak upravené) zpět do těla postiženého.

Nanog – protein věčného mládí

Připustíme-li, že omlazovacím, respektive ozdravným elixírem pro člověka a jiné mnohobuněčné živočichy by mohl být „koktejl“ s vhodně vybranými kmenovými buňkami, pak se prazákladním elixírem věčného mládí stává substance, která může život kmenové buňky udržet neomezeně dlouho v kolejích opakovaného dělení. Život kmenové buňky bývá totiž přirozeně ukončen diferenciačním procesem – konečným údělem buňky, která již není schopna se dále dělit, je smrt. Diferencovaná buňka ještě sice žije a koná dílo ve prospěch celku, ale už je odsouzena, neboť podstoupila smrt reprodukční. Jakoby již nastoupila na Charonovu loď a směřovala k druhému břehu řeky Styx, odkud není návratu.

„Opravdu platí, že za žádných okolností nelze buňku, která je odsouzena k smrti, zachránit?“ Tuto otázku jsem si položil před lety, když jsem v naší laboratoři, zabývající se kvasinkami, zadal dvě diplomové práce na téma s poněkud nechutným pracovním názvem „Fúze s mrtvolou“. O co tehdy šlo: Protože jsme využívali indukovanou fúzi protoplastů u kvasinek pro konstrukci nových průmyslových kmenů a zaváděli nové selekční techniky pro izolaci hybridů, chtěli jsme zjistit, zda genom buňky usmrcené např. UV zářením nebo zvýšenou teplotou může být zachráněn pro budoucnost fúzí usmrceného protoplastu s protoplastem živé buňky. Vybrali jsme si dva druhy kvasinek, Saccharomyces cerevisiae a Schizosaccharomyces pombe. Diplomantky M. Korabečná a D. Tomešová (nyní Grünová) tehdy prokázaly, že taková záchrana mrtvé buňky je možná, i když hybridy tohoto typu vznikaly s mnohem menší frekvencí než hybridy mezi dvěma živými buňkami. Podobné výsledky ohlásili z maďarského Szegedu J. Kuczera a L. Ferenczy, kteří dokonce prokázali, že když jsou buňky otráveny dvěma různými jedy, může z fúze takto usmrcených buněk povstat živáček. V naší poněkud cynické hantýrce: „Mrtvoly se zachránily tím, že splynuly.“ Tento poznatek navíc ukázal, že selekci hybridů není nutné provádět až po fúzi. Může být zajištěna usmrcením rodičů předem. Jen hybridi mají pak naději na přežití. Na podobném principu je založena selekce tzv. hybridomů, které lze množit a pomocí nich získávat monoklonální protilátky. Hybridomy vznikají fúzí lymfocytů s rakovinnými buňkami. Rodičovské lymfocyty není třeba eliminovat, neboť se – podobně jako jiné diferencované buňky – nemnoží. Stačí odstranit jen rakovinné rodičovské buňky a zůstanou hledané hybridomy. V případě vzniku hybridomů byla naznačena cesta k obnově dělení, ne však k dediferenciaci na buňku kmenovou. Odvození hybridomu od rakovinné buňky také není právě nejlepším doporučením pro transplantaci. Bylo však ukázáno, že jen malá obměna postupu stačí k tomu, aby se diferencovaná buňka začala opět dělit jako kmenová buňka a jakožto taková se mohla diferencovat na jinou specializovanou buňku. Stane se tak např. fúzí s vhodně vybranou kmenovou buňkou. Další možnost přináší přenos jádra diferencované buňky do oocytu. Tato metoda si však zaslouží obšírnější komentář, neboť rozvířila v nedávné minulosti ostrou mediální diskusi, zejména v souvislosti s klonováním, a hlavně s ovečkou Dolly.

Po historických experimentech M. R. Briggse a spol. v padesátých letech minulého století se otevřela cesta ke klonování zvířat. Studie na obojživelnících totiž ukázaly, že jádro somatické buňky má schopnost řídit embryonální vývoj, je-li přeneseno do oocytu. Jde pochopitelně o umělé oplodnění, mnohem méně účinné než od spermie. S pokračujícím vývojovým stadiem somatické buňky se její schopnost „oplodňovat“ snižuje. Diferencované a embryonální buňky se chovají velmi odlišně. Např. jen malá frakce (1–3 %) myších blastocyst odvozených od jader diferencovaných somatických buněk se plně vyvine v embryo a ještě menší frakce takto získaných embryí dospěje. Naproti tomu třetina jader z blastocysty „oplodní“ oocyt tak, že nakonec dojde k porodu. Ačkoliv asi 70 % somatických klonů se in vitro vyvine do stadia blastocysty, jejich vývoj se zastaví brzy po transplantaci. To vysvětluje, proč cesta k ovečce Dolly byla tak trnitá. Velmi závažným zjištěním bylo, že rozdíl mezi diferencovanými somatickými buňkami a embryonálními buňkami je způsoben tím, že exprese genu Oct4 je výrazná pouze v blastocystách odvozených od embryonálních buněk. Buňky bez funkčního genu pro Oct4-protein sice dosáhnou stadia blastocysty, ale nevytvářejí v ní vnitřní buněčnou hmotu, ze které se odvozují tkáně dospělého organizmu. Oct4-protein je aktivátorem transkripce skupiny genů vyznačujících se doménou POU, které jsou důležité pro pokračování vývoje embrya. Z výše uvedených zjištění vyplynulo nejen to, že dospělý organizmus, jako byla např. ovce Dolly, může být počat i přenesením jádra diferencované buňky do oocytu, ale také to, že pro zdárný průběh následných diferenciací, pro něž je potřebné udržení pluripotence blastocystových buňek, je důležitý protein Oct4.

V předcházejících odstavcích jsme si ukázali, že když buňka nasedne do Cháronovy loďky, a dokonce i když vstoupí na opačném břehu do „Země nebožtíků“, zůstává určitá, byť malá naděje, že se s naší pomocí vrátí zpět mezi živé. Bezpečnější však je do loďky vůbec nenastoupit a prostě mezi živými zůstat.

Nedávno bylo zjištěno, že zvýšená exprese Oct4 žene buňky do diferenciace, zatímco jeho normální hladina udržuje pluripotenci u buněk vnitřní hmoty blastocysty. To znamená, že pravděpodobně existují další faktory, podílející se hlavně na udržení pluripotence a množení embryonálních buněk. Kaoru Mitsui s kolegy z Nara Institute of Science and Technology v Japonsku a Ian Chambers s kolegy z Institute for Stem Cell Research ve Skotsku prověřovali řadu kandidátů na tuto funkci. ¹⁾ A skutečně objevili a charakterizovali protein, který může sloužit jako vstupenka do Tir nan Og, keltské „Země věčného mládí“. Protein, označovaný jako Nanog, je hledaným elixírem alespoň pro kmenové buňky, ve kterých potlačuje diferenciaci. Experimentálně byl prokázán nejdříve u myší, ale pomocí srovnávací sekvenční analýzy byl vyhledán jeho analog i u člověka. Ejhle, znalost sekvence bází v lidského genomu přinesla další plody!