Prodlužování DNA a mikrosatelity

Genetické informace všech známých organizmů jsou zakódovány v pořadí nukleotidů A, C, G a T ve dvouvláknových molekulách kyseliny deoxyribonukleové (DNA). Tyto molekuly se dědí z rodičů na potomky a jejich zdvojení (replikaci) zajišťuje enzym polymeráza. První genetické molekuly se na naší planetě objevily před několika miliardami let, a proto se stěží někdy dozvíme, jak to s jejich původem doopravdy bylo. To nám ale nebrání zkoumat, jak to být mohlo. V tomto ohledu stojí za zmínku experimenty, které před čtyřiceti lety zveřejnili nositel Nobelovy ceny Arthur Kornberg a jeho spolupracovníci. Ukázali tenkrát, že polymeráza není jen molekulární stroj na kopírování již existujících genetických molekul. Umí totiž také generovat genetické informace de novo, tj. bez templátové DNA, která jí normálně slouží jako předloha k syntéze kopií.

Replikovat DNA je možno i ve zkumavce, protože podmínky pro takové experimenty jsou překvapivě jednoduché. A můžeme je ještě více zjednodušit tím, že polymeráze nedáme k dispozici žádný templát, podle kterého by mohla dělat kopie. Za této situace v prvních hodinách nové molekuly DNA nevzniknou, ale pak v některých případech vznikat začnou. Časová prodleva zřejmě souvisí s malou pravděpodobností vzniku molekulárních vazeb, jejichž vytvoření je pro započetí syntézy DNA nutné. Analýza primární struktury takto stvořené molekuly DNA přinesla překvapení. Přestože polymeráza měla k dispozici prekurzory všech čtyř nukleotidů, použila k syntéze DNA jen A a T. Dále se ukázalo, že tyto dva nukleotidy jsou uspořádány do střídavé posloupnosti. Není bez zajímavosti, že tato střídavá posloupnost vnáší do DNA pozoruhodné vlastnosti a že v genetických molekulách současných organizmů se hojně vyskytují poměrně dlouhé posloupnosti, v nichž se T střídá s A.

Polymerázy termofilních organizmů

Další výsledky syntézy DNA de novo nedávno zveřejnili japonští badatelé, kteří použili polymerázy termofilních organizmů. Ty Kornberg nestudoval. Termofilní polymerázy jsou dnes běžné, protože se používají při PCR (viz Vesmír 69, 309, 1990/6, Vesmír 74, 546, 1995/10, Vesmír 77, 444, 1998/8). Jejich zajímavost ale v kontextu tohoto článku spočívá v tom, že vznik života je často spojován s prostředím, v němž termofilní bakterie žijí. Ukázalo se, že tyto termostabilní polymerázy také produkují DNA v nepřítomnosti templátu. Nukleotidové posloupnosti vznikajících molekul DNA jsou repetitivní podobně jako výše uvedená střídavá posloupnost T a A, ale jejich opakující se motivy jsou složitější. Ještě pozoruhodnější je závislost opakujícího se motivu na teplotě a koncentraci iontů prostředí, ve kterém replikace probíhá. Při teplotě 60 °C je tímto opakujícím se motivem TAAT, při 84 °C TATCCGGA a při 89 °C TATCGCGATAGCGATCGC. Při 74 °C vznikají molekuly obsahující opakování motivu TATCTAG, po přidání iontů na koncentraci 50 mM je ale tímto motivem TATATACG a při koncentraci 100 mM TATAGTTATAAC. Délka molekul DNA vznikajících de novo je impozantní. Může dosahovat až 200 tisíc nukleotidů, tedy kolem 10 tisíc tandemových opakování základního motivu. Pozornému čtenáři jistě neuniklo, že polymerázy začínají syntézu DNA de novo dinukleotidem TA, který vnáší do DNA pozoruhodné biofyzikální vlastnosti.

Uvedené skutečnosti jsou zajímavé mj. proto, že genetické molekuly současných organizmů obsahují velká množství tandemových opakování krátkých oligonukleotidů, která zřejmě mohou vznikat beztemplátovou syntézou DNA při zvýšených teplotách v přítomnosti různých koncentrací iontů. Těmto opakováním se říká mikrosatelity. Jejich výskyt je obzvlášť vysoký např. v lidském genomu, tj. souboru všech genetických molekul člověka. Mikrosatelity mutují asi 10 000krát rychleji než jiné oblasti v genomu a tyto mutace mají zvláštní podobu. Nejde o běžné změny, delece nebo inzerce, ale o přidávání nebo ubývání kopií základního motivu. Těmto procesům se říká dynamické mutace. Pozoruhodné jsou například tím, že prodloužení některých mikrosatelitů nad kritickou hranici má vztah k řadě neurodegenerativních onemocnění (viz článek, Vesmír 78, 307, 1999/6).

Známých nukleotidových posloupností přibývá

Nukleotidové posloupnosti fragmentů pocházejících z různých organizmů jsou postupně sestavovány již asi dvacet let. Dnes se celková délka zjištěných posloupností blíží dvěma miliardám nukleotidů. Z nich více než polovina pochází z genomu člověka. Známých nukleotidových posloupností lidského genomu přibývá takovým tempem, že se hovoří už i o roku 2000 jako o termínu, kdy bude primární struktura lidského genomu kompletně stanovena.

Dostupnost informací o uspořádání nukleotidů v lidském genomu poskytne řadu nových možností. Mnohé jsou ale k dispozici už více než patnáct let. Například počítačové studie nukleotidových posloupností má smysl provádět i u genomů virů a dílčích úseků genomů organizmů, jejichž primární struktura je dávno známa. Tyto studie přinášejí jinak nezjistitelné poznatky o zákonitostech uspořádání nukleotidů v genech a genomech a o změnách těchto uspořádání v průběhu evoluce. Počítačová analýza nukleotidových posloupností již byla také použita ke studiu prodlužování mikrosatelitů v lidském genomu.

Již určené nukleotidové posloupnosti genomů a jejich částí badatelé ukládají do databází, které jsou dostupné přes internet. Pomocí vhodného software můžeme z databáze vypreparovat všechny mikrosatelity včetně např. 50 okolních nukleotidů na každou stranu. Zajímavé je pracovat nejen s nativními posloupnostmi, ale také s jejich alternativními reprezentacemi. Pokud např z nějakého důvodu nechceme nebo nemůžeme rozlišovan mezi purinovými bazemi A a G, napíšeme podle zavedené konvence R. Podobně obě pyrimidinové báze C a T můžeme nahradit písmenem Y, a páry bazí A—T a G—C můžeme nahradit symboly W, resp. S. S využitím těchto a dalších substancí můžeme každou nukleotidovou posloupnost převést do řady alternativních podob, které zkoumáme paralelně s nativními posloupnostmi. Smysluplnost takového počínání plyne ze skutečnosti, že i genetické informace jsou kódovány způsobem, kdy v mnoha případech nezáleží na tom, zda se v daném místě nukleotidové posloupnosti nachází A nebo G, popřípadě A nebo T.

Nukleotidová posloupnost AGACACATAC ATATATATAT ATACATACAT GA obsahuje mikrosatelit (AT)n dlouhý 13 nukleotidů. Po přepsání do reprezentace RY má tato posloupnost podobu RRRYRYRYRY RYRYRYRYRY RYRYRYRYRY RR, v níž je mikrosatelit (RY)n dlouhý 29 nukleotidů. Většina mikrosatelitů se po přepsání do vhodné alternativní podoby jakoby prodlouží, a to často velmi podstatně. Mikrosatelity tedy nekončí náhle, jak se doposud předpokládalo, ale napojují se k okolní DNA pozvolna tak, že s rostoucí vzdáleností od středu mikrosatelitu narůstá množství mutací narušujících jeho ideální podobu. Přitom ale tyto mutace do značné vzdálenosti od centra mikrosatelitu zachovávají nějakou jeho důležitou charakteristiku. Ve výše uvedeném příkladu je touto důležitou charakteristikou pravidelné střídání purinových (A, C) a pyrimidinových (C, T) nukleotidů.

K čemu slouží mikrosatelity?

Provedené počítačové analýzy ukazují, že mikrosatelity jsou ve svém zavedeném pojetí jen speciálním případem mnohem delších a častěji se v genomech vyskytujících nukleotidových posloupností, které lze zapsat jednoduchým vzorcem. V lidském genomu se např. nachází úsek 404 po sobě následujících purinových nukleotidů. Ten označíme (R)₄₀₄. Extrapolace dosavadních studií dílčích nukleotidových posloupností vede k z ávěru, že miliarda (nebo možná i dvě) ze tří miliard nukleotidů lidského genomu může být popsána formou jednoduchých vzorců.

Stále přibývá studií srovnávajících nukleotidové posloupnosti funkčně homologních oblastí genomů evolučně různě vzdálených organizmů. Tyto studie ukazují, že četné mikrosatelity přetrvaly v genomech po mnoho milionů let. Asi jsou tedy pro fungování buňky životně důležité. V čem ale, když většinou nekódují proteiny?

Odpověď lze vyvodit z existujících znalostí. Geny sice kódují strukturu proteinů, ale nikoli už další potřebné informace. Bezchybné fungování buněk vyžaduje nejen neporušenou strukturu proteinů, ale také jejich správné koncentrace v každém okamžiku. Kde je však uloženo a jak funguje ono obrovské množství informací potřebné k tomu, aby v každé lidské buňce byly koordinovány časové průběhy koncentrací asi 100 000 proteinů včetně schopnosti reakce na změny vnějších podmínek? Tuto koordinaci zřejmě zajišťují dva metry DNA, které jsou natěsnány v jádru každé lidské buňky. Natěsnání DNA v buněčném jádru dává návod k úvahám, jakého druhu jsou molekulární informace rozhodující o tom, kolik je kdy kterého proteinu v buňce k dispozici i k čemu mohou sloužit mikrosatelity.

Mikrosatelity se od ostatní DNA liší svou nestabilitou v klasické dvojité šroubovici. Ve srovnání s běžnou DNA mikrosatelity snadno a reverzibilně přeskakují do alternativních prostorových uspořádání, která vykazují pozměněné vazebné i jiné vlastnosti. Mohou proto plnit funkci molekulárních přepínačů, bez kterých si řízení buňky a její schopnost reagovat na změny vnějších podmínek nedokážeme představit. Navíc tato konformační nestabilita vede k tomu, že při replikaci se mikrosatelity zřejmě jeví polymeráze jiné, než ve skutečnosti jsou. Na to polymeráza reaguje změnou délky nově syntetizovaného řetězce.

Existuje stále více dílčích poznatků o tom, že fyzikální vlastnosti DNA ovlivňují genetické, evoluční a patologické procesy. Výzkum souvislostí mezi fyzikálními a biologickými vlastnostmi DNA nás přibližuje pochopení molekulárních základů života. Ke zkoumání těchto souvislostí máme dnes již téměř všechny potřebné nástroje. Projekt lidský genom brzy poskytne informace, které mj. umožní, aby z biofyzikálních analýz DNA mohla těžit i medicína. ¹⁾