Výroba efedrinu jako příklad biotechnologie

Biotechnologie sahá vlastně až do doby, kdy se člověk 15 000 až 10 000 let před Kristem začal koncem poslední doby ledové usazovat jako pastevec a pěstovat dobytek. Neboť co to je, když se zvíře krmí a tento substrát se přeměňuje v maso, tuk a jiné užitečné věci? A co naši prapředkové, kteří vyráběli kvašené nápoje? Již za Abraháma (1900 - 1700 let před Kristem) slavil Melchizedech oběť chleba a vína. Kristovi na kříži nabídli římští vojáci ocet na yzopu a houbě, takže Židé museli mít ocetnici, v níž octové bakterie oxidovaly etanol na kyselinu octovou. Donedávna se tradovala definice biotechnologie jako procesu, v němž se vyrábějí látky pomocí živých organizmů. Dnes je však třeba tuto definici opravit - je to každý proces, v němž se alespoň jeden krok uskutečňuje na principu enzymové reakce (např. výroba sójové omáčky je založena na hydrolýze bílkovin směsí proteáz).

Efedrin (1 R,2 S-(-)-1-fenyl-2(metylamino)-1-propanol) a jeho N-deriváty patří svou strukturou a účinky mezi sympatomimetické aminy, léčiva analogická přirozeným přenašečům adrenalinu a noradrenalinu. Tato skupina farmak dráždí sympaticus, tj. zvyšuje tepovou frekvenci a krevní tlak a vede k rozšíření dýchacích cest. Základní strukturou většiny sympatomimetik je fenyletyl-, resp. fenylizopropylaminové seskupení, tj. spojení bazické aminové funkce a aromatického jádra řetězcem o dvou, resp. třech uhlíkatých atomech. Modifikací funkčních skupin tohoto skeletu lze do jisté míry měnit sympatomimetický účinek zmíněných sloučenin.

Efedrin byl původně (r. 1885) izolován z čínské drogy Ma-Huang, později z rostliny Ephedra vulgaris, která roste v jižní Evropě, Asii a Africe a obsahuje 2 - 3 % efedrinu. Izolace efedrinu se prováděla snadno tak, že se suchá rostlina extrahovala organickými rozpouštědly a báze efedrinu se dělily krystalizací. Vzhledem k požadavkům na množství efedrinu potřebné pro farmaceutický průmysl a nedostatečnost výroby této látky z přírodních zdrojů se systematicky zkoumaly syntetické metody. Byla vypracována řada syntéz, jejichž hlavním nedostatkem byl nestereospecifický průběh, tj. vznik racemických směsí (směsí, v nichž se optické aktivity složek vzájemně ruší), a vznik řady vedlejších produktů způsobujících obtížné dělení jednotlivých látek.

Z hlediska dnešních možností a potřeb farmaceutického průmyslu je nejvýhodnější metodou výroby efedrinu kombinovaný postup využívající biosynteticky připraveného fenylacetylkarbinolu (L-(-)-1-fenyl-1-hydroxy-2-propanon, FAK), který se v syntetickém stupni podrobí katalytické reduktivní aminaci. Biosyntéza FAK představuje biotechnologický krok procesu. Využívá Neubergova principu, objeveného r. 1924, podle něhož aldehydy mechanizmem aldolové kondenzace s aktivním acetaldehydem na kvasničné pyruvátdekarboxyláze kondenzují na ketoly, tj. sloučeniny s ketonovou a alkoholovou skupinou vázané na sousední uhlíkové atomy. FAK jako jeden z ketolů vzniká biotransformací benzaldehydu (BA) pomocí kvasinek vytvářejících aktivní acetaldehyd z cukru, tj. sacharózy, která se tak stává vedle substrátu, jímž je benzaldehydu, kosubstrátem.

Biotransformace benzaldehydu a sacharózy na FAK zahrnuje kultivaci (propagaci) kvasinek Saccharomyces sp. a vlastní biotransfomaci, přičemž oba stupně představují fermentační proces probíhající ve fermentačním tanku. Vlastní biotransfomace se zahajuje na konci exponenciální fáze růstu kvasinek, kdy klesá koncentrace redukujících látek na nulu a kdy dochází k potlačení glukózou, a sice mohutnou dávkou sacharózy (2,5 %) a dávkou benzaldehydu (0,35 %). Tím se vyvolá glukózový neboli Crabtree efekt, tj. potlačení aerobního metabolizmu vlivem glukózy, která vzniká ze sacharózy invertázovou reakcí a metabolizuje se v této fázi převážně anaerobně, tj. přes pyruvát (kyselinu pyrohroznovou) a acetaldehyd na etanol. Část acetaldehydu v aktivní formě (acetaldehyd vázaný na pyruvátdekarboxylázu přes její koenzym, tiaminpyrofosfát) však kondenzuje s benzaldehydem na FAK a další produkty, jejichž koncentrace ve fermentační tekutině však nepřesahuje hodnotu 0,08 %. Biotransformace potom pokračuje řízeným dávkováním benzaldehydu a sacharózy po dobu asi 13 hodin, za kterou se spotřebuje okolo 4 % cukru a 1,25 až 1,4 % benzaldehydu. Na konci biotransformace se ve větší míře objevuje benzylalkohol (až 0,25 %),

vznikající redukcí benzaldehydu pomocí kvasničné alkoholdehydrogenázy, FAK (až 1,24 %) a etanol (až 2 %) jako konečný produkt alkoholového anaerobního kvašení.

Celá situace je znázorněna na obrázku (obrázek). Sacharóza se za katalýzy invertázou přeměňuje na glukózu a fruktózu, které jsou transportovány do buněk a přeměňovány pomocí enzymů glykolytického cyklu (např. fosfofruktokinázou, glyceraldehydfosfátdehydrogenázou, enolázou aj.) na pyruvát. Ten pak je zpracováván v anaerobním metabolizmu (pyruvátdekarboxyláza, alkoholdehydrogenáza) na hlavní produkt, etanol, za tvorby adenosintrifosfátu (ATP), který představuje pro buňku zdroj energie, a nikotinamidadenindinukleotidu v oxidované formě (NAD⁺), který jako koenzym dehydrogenáz slouží k oxidacím substrátů a je v podstatě transporterem vodíku (NAD⁺ + 2 H⁺ NADH + H⁺). Pyruvát však vstupuje také do aerobního metabolizmu (citrátový neboli Krebsův cyklus napojený na dýchací řetězec v mitochondriích), přičemž cílem tohoto procesu je v tomto případě především tvorba ATP (energie) a NAD⁺ pomocí vzdušného kyslíku. Jak je totiž znázorněno na obrázku, BA a FAK (do jisté míry také benzylalkohol) jako toxická organická rozpouštědla denaturují enzymy a jiné bílkoviny a poškozují buněčnou stěnu, cytoplazmaticku (buněčnou) membránu a mitochondriální membrány. V důsledku toho ve vysoce exponované kvasničné buňce probíhají procesy detoxikace BA na FAK, jehož koncentrace však neustále stoupá. Buňka se proto neobejde s nedostatečným množstvím ATP a NAD⁺ dodávaným z anaerobního metobolizmu. Tvorba těchto důležitých látek v aerobním metabolizmu je mnohem mohutnější. A tak ačkoli biosyntéza FAK probíhá v anaerobní větvi, závisí na aerobním metabolizmu glukózy.

Na konci biotransformace se kvasničná suspenze zahustí na velkokapacitních průtokových odstředivkách a FAK se pak extrahuje na protiproudných kolonách do butylacetátu (butylester kyseliny octové). Potom se butylacetátový extrakt zahustí na koncentrát s obsahem asi 50 % FAK. Ten se podrobí katalytické reduktivní aminaci v reaktorech pomocí metylaminu a plynného vodíku za zvýšeného tlaku, zvýšené teploty a přítomnosti katalyzátoru, jímž bývá platinová čerň nanesená na nosiči. Přes ketimin jako meziprodukt tak vzniká efedrin, převážně jako L-(-)-efedrin, i když je doprovázen malými množstvími vedlejších produktů a svých opticky aktivních izomerů, jimiž jsou D-(+)-efedrin a L-(-)- a D-(+)-pseudoefedrin. Výhodou tohoto procesu je vysoká stereoselektivita, což znamená vysoký výtěžek žádané L-(-)-formy efedrinu. Efedrin se musí z reakční směsi izolovat, načež se čistí krystalizací a jako hydrochlorid se distribuuje do farmaceutických podniků k výrobě léků.

Efedrin se nejčastěji používá k léčbě alergických stavů (asthma bronchiale) v kombinaci s antihistaminiky a k léčbě oběhových poruch, jako jsou vazomotorický kolaps, sinusová bradykardie (tj. zpomalená srdeční činnost) aj. Efedrin byl obsažen v preparátu k léčbě průdušek Yastyl, který byl údajně návykový. V seznamu návykových látek pro rok 1994 již efedrin obsažen není, nicméně se ho zneužívá k přípravě asi 10krát účinnějšího Pervitinu, který patří mezi psychomimetika (viz článek Milana Dundra 74, 189, 1995/4). Mezi narkomany je znám pod názvem perník a na zahraničním trhu se prodává pod názvem Czecho či Tchéquo.