Jak reagují jednotlivé molekuly enzymu?

Katalytická aktivita enzymů připravených i ve velmi čistém stavu je statistickým výsledkem působení určité množiny molekul v roztoku. Tato veličina však nedává žádnou informaci o tom, jakou aktivitu mají jednotlivé molekuly enzymu. Většinou předpokládáme, že se ve své aktivitě tyto molekuly navzájem příliš neliší, máme-li k dispozici enzym, jehož homogenita byla prokázána nějakou fyzikálně-chemickou metodou, např. rozdělením roztoku enzymu ve stejnosměrném elektrickém poli (elektroforézou).

Koncentrace enzymů v buňkách a v biologických tekutinách je ovšem tak nízká, že ji není možno měřit přímo, a využívají se tedy kinetické metody založené na úbytku substrátu nebo přírůstku produktu v čase. Koncentrace použitého substrátu se pohybuje řádově kolem 10^–3 mol/l a zpravidla převyšuje koncentraci enzymu asi milionkrát, takže při kinetickém stanovení odpovídá jeho koncetrace asi 10^–9 mol/l. To je řádově asi 10¹⁴ molekul enzymu v litru (neboli řádově asi 100 bilionů molekul v litru). Využitím citlivé fluorescenční detekce je však možné měřit aktivitu jednotlivých molekul enzymu v kapiláře o velmi úzkém průměru (20 μm), a to na základě fluorescence produktu enzymové reakce, jímž může být redukovaná forma koenzymu nikotinamidadenindinukleotidu (NADH). Q. Xue a E. S. Yeung připravili velmi zředěné roztoky jednoho z izoenzymů laktátdehydrogenázy, LDH-1, tzv. "srdeční" formy enzymu, katalyzujícího přeměnu laktátu na pyruvát za vzniku NADH jako akceptoru elektronů při oxidoredukční reakci. Izoenzymy patří k mnohočetným formám enzymů, tj. katalyzují stejnou chemickou reakci, ale liší se svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi, např. elektroforetickou pohyblivostí. Vyskytují se u stejného druhu organizmů a jejich rozdíly jsou dány odlišností v pořadí aminokyselin bílkovinné části enzymu, tedy rozdíly v tzv. primární struktuře, která je zase podmíněna odlišností v kódujících genech. Izoenzym LDH-1 obsahuje 4 podjednotky H, kódované jediným genem, a tyto podjednotky jsou nekovalentně vázány v tetramerní molekule enzymu. Roztok tohoto enzymu byl připraven opakovaným ředěním, až bylo dosaženo velmi nízké koncentrace 7,6.10^–17 a 1,5.10^–16 mol/l. V objemu 290 nl (nanolitr = 10^–9 litru), který byl analyzován, to odpovídá teoreticky 15, resp. 30 molekulám enzymu. Tento objem byl inkubován při 40 °C v kapiláře o průměru 20 μm s koenzymem NAD+ (1 mmol/l) a laktátem (3 mmol/l) jako substrátem v pufru o pH 9,1 po dobu 1 hodiny. Za tuto dobu se pro každou molekulu LDH-1 vytvořilo asi 20 milionů molekul NADH jako jednoho z produktů reakce (a rovněž stejné množství molekul pyruvátu). Molekuly NADH utvořily v kapiláře zónu kolem každé molekuly enzymu, a tyto zóny spolu s molekulami enzymu pak byly pozorovány individuálně. Roztok v kapiláře byl uveden do elektroforetického pohybu při stejnosměrném napětí 24 kV rychlostí 11 cm za minutu. Molekuly NADH se pohybovaly jako zóna kolem každé pohybující se molekuly enzymu. Fluorescence molekul NADH byla vzbuzena ozářením laserovým paprskem o vlnové délce 305 nm, monitorována při vlnové délce 460 nm, soustředěna objektivem mikroskopu a registrována fotocelou a fotonásobičem. Laserový paprsek byl fokusován do šířky 10 μm, takže byla plynule registrována fluorescence pohybujících se zón o této šířce. Byl tak získán záznam fluorescence zón produktů reakce katalyzované jednotlivými molekulami LDH-1. Tento záznam obsahoval 8 fluorescenčních maxim při nižší koncentraci enzymu a 13 maxim při koncentraci dvojnásobné, tedy méně než odpovídalo vypočteným hodnotám, což bylo asi způsobeno chybou ředění při tak nízkých koncentracích použitých roztoků enzymu.

Několikerým opakováním experimentu se však ukázalo, že se aktivita molekul enzymu lišila navzájem až čtyřnásobně. Rozdíly v aktivitě jednotlivých molekul se dají vyložit konformačními změnami tetramerních molekul, čímž se některá aktivní centra jednotlivých podjednotek enzymu stávají méně dostupnými pro substrát. Tyto konformery byly stálé i při prodloužení experimentu na dvakrát 1 hodinu inkubace se substrátem při 21 °C. Uvedená technika tedy umožňuje přímo experimentálně potvrdit některé teoretické předpoklady konformačních změn uvažovaných pro oligomerní nebo allosterické enzymy a pozorovat aktivitu jednotlivých konformerů přímo. Tato metoda ukazuje také na dosud netušené možnosti enzymologie a biotechnologie, tj. na možnost separovat a izolovat v malém objemu jednotlivé molekuly. (Nature 373, 681, 1995)