Vesmírná škola 2Vesmírná škola 2Vesmírná škola 2Vesmírná škola 2Vesmírná škola 2Vesmírná škola 2

Aktuální číslo:

2024/12

Téma měsíce:

Expedice

Obálka čísla

Srpkovitá anémie

 |  5. 3. 1994
 |  Vesmír 73, 144, 1994/3

Značná část defektů červených krvinek je způsobena anomáliemi hemoglobinů. Z klinického hlediska je můžeme dělit do dvou základních skupin, na odchylky kvantitativního rázu a odchylky kvalitativní. Většinou jde o dědičně podmíněné poruchy, které ve světě postihují miliony osob. Kvantitavní odchylky mohou být reprezentovány tzv. talasémiemi a kvalitativní hemoglobinopatiemi. Mezi těmi představuje drepanocytóza neboli srpkovitá anémie výjimečný příklad toho, jak přispěla moderní věda k poznání příčiny choroby. Při jejím poznávání byly použity všechny prostředky současné biologie a chemie a otevřelo se mnoho nových cest. Uplatnily se: formální genetika, analýza aminokyselinné sekvence bílkovin, molekulární modelování, klonování genů, transgenní zvířata, molekulární farmakologie – abychom se zmínili aspoň o některých.

Hemoglobiny byly prvními nejlépe prozkoumanými bílkovinami a nezůstaly pozadu ani při našem poznávání genomu. Přes ohromný pokrok v pochopení příčiny nebylo zatím uspokojivého pokroku v léčení této choroby dosaženo.

Historie drepanocytózy započala r.1910, kdy si J. B. Herrick povšiml, že červené krvinky černošského dítěte trpícího smrtící chudokrevností mají zvláštní tvar a při pozorování v mikroskopu připomínají srp. Odtud je odvozen i název falciformní anémie, drepanocytóza nebo moderně sickle cell anemia. A jak už to bývá, objev, pro který je jeho jméno vzpomínáno nejčastěji, nepovažoval Herrick za svůj hlavní příspěvek tehdejší medicínské vědě. Roku 1917 zjistil V. E. Emmel, že deformace krvinek je spojena s odkysličením, ke kterému dochází v zásobovaných tkáních.

Tato chronická anémie dětského věku se projevuje těžkými oběhovými příhodami, způsobenými mnohočetnými drobnými záhatěmi orgánů a vedoucími k místnímu rozpadu kostní tkáně, plic, jater, ale i mozku. Onemocnění je provázeno septikémiemi s rozpadem sleziny a končí selháváním kostní dřeně a oběhu. V Africe takové děti umíraly velice záhy poté, co se objevily klinické příznaky – během několika měsíců. Dnes jsou na světě postižených dětí stovky tisíc, v některých zemích je drepanocytóza častá, v jiných, a mezi ně patří i Česká republika, téměř neznámá. To však by rozhodně nemělo být důvodem, abychom jejího příkladu a přínosu pro naše lékařské a obecně přírodovědné znalosti nevyužili.

Od Herrickova pozorování uplynulo víc než 83 let. Jsou vyplněny řešením nesmírného množství problémů a příčinných souvislostí, které byly za tento fenomén odpovědné. Na samém počátku příčin nemoci je nepatrná změna složení kyslíkového přenašeče v krvi – hemoglobinu. Jeho molekuly sestávají ze čtyř bílkovinných řetězců, u dospělého ze dvou alfa a dvou beta, se kterými jsou spojeny čtyři molekuly hemu, na něž se váže kyslík přenášený krví. Změna hemoglobinu vyvolávající drepanocytózu je způsobena mutací genu kódujícího řetězec beta (na 6. pozici je nahražena kyselina glutamová valinem). Mutovaný hemoglobin se v krvinkách nachází ve značném množství, a když přechází na deoxygenovaný stav, polymeruje a vytváří dlouhá pevná vlákna, která deformují krvinku a dávají jí charakteristický srpkovitý tvar. I když je tento fenomén reverzibilní, vede k předčasnému rozpadu krvinek a k chronické anémii. Kromě toho krvinky se zmenšenou deformabilitou způsobenou přítomností „vykrystalizovaného“ hemoglobinu ucpávají kapiláry a jsou příčinou zástavy průtoku krve cévami.

Identifikace abnormálního hemoglobinového řetězce r. 1949 byla revolucí v medicínském i vědeckém světě. Slavný americký fyzikální chemik Linus Pauling (Nobelova cena 1954), učitel a konkurent J. D. Watsona a F. H. C. Cricka, kteří dostali Nobelovu cenu za medicínu (1962) společně s M. H. F. Wilkinsem za rozluštění dvojšroubovice deoxyribonukleové kyseliny, použil ke zkoumání obsahu krvinek v té době novou metodu elektroforézy, kterou vyvinul švédský biochemik Arne Tiselius (Nobelova cena za chemii 1948). Tato technika dovoluje dělení látek obsažených ve směsi podle rozdílu v pohyblivosti v elektrickém poli. Linus Pauling zjistil, že hemoglobin přítomný v drepanocytech, který nazval hemoglobin S (HbS, podle sickle = srp), se pohybuje pomaleji než hemoglobin zdravých osob – hemoglobin A (HbA, adult = dospělý). Navíc u rodičů, jimž se narodilo nemocné dítě, nalezl oba hemoglobiny (HbS i HbA), a téměř ve stejném množství. Tak byl odhalen biochemický znak ukazující na přítomnost choroby a rovněž dědičný přenos. Ze dvou kopií genu pro řetězec beta nacházejících se na chromozomech v našich buňkách pochází jedna od matky a druhá od otce. K vývinu choroby dojde v případě, že jsou obě kopie změněny (homozygotní děti). Jde o recesivní znak, na rozdíl od dominantního, kdy k projevu choroby stačí přítomnost jedné změněné kopie.

Mnoho badatelů, kteří se věnovali výzkumu v letech 1950 – 1960, si všimlo, že děti, které zdědily od jednoho rodiče hemoglobin S a od druhého jiný abnormální hemoglobin (těch je dnes známo již několik set), mohou být nemocné, ale mohou být i úplně zdravé (bez klinických příznaků anémie). Některé typy abnormálních hemoglobinů drepanocytózu zhoršují, jiné ji naopak mírní. Vzhledem k abnormálním hemoglobinům vyskytujícím se na celém světě je nejčastější kombinace HbS/HbC nebo HbS/HbE, které obě znamenají ve srovnání s normálním heterozygotním stavem HbS/HbA kombinaci méně příznivou. V porovnání s homozygotní konstelací HbS/HbS je většinou HbS/HbC mírnější, ačkoliv více inklinuje k cévním uzávěrům. Vzhledem k velkému množství identifikovaných mutací hemoglobinových genů vznikla trochu naivní představa, že každá populace má své vlastní mutace.

Původní názvosloví vycházelo ze skromného předpokladu, že k jejich označení budou stačit písmenka abecedy. Ani jeden z obou předpokladů se nesplnil. Vedle rozšířených patologických hemoglobinů s charakteristickou geografickou distribucí jsou ojedinělé mutace nahodile roztroušeny po celém světě (jejich označení souvisí s místem nálezu). Záleží jen na tom, kde je poprvé zachytíme.

Například studie uskutečněná v laboratoři J. Rosy během 70. let identifikovala ve francouzské populaci víc než sto různých abnormálních hemoglobinů.

Jejich identifikace se stala možnou díky izoelektrofokusaci, technice odvozené od klasické elektroforézy, která dovoluje rozdělení velmi složitých směsí. Tato a další techniky umožnily izolovat víc než osm set různých hemoglobinových mutací na celém světě. Metody molekulární biologie jistě toto číslo ještě značně zvýší.

Zmíněné studie měly nesmírný význam i pro základní výzkum. Počínaje r. 1968 se staly předmětem zájmu M. F. Perutze, původně vídeňského biochemika pracujícího ve Velké Británii, a vedly ke studii o vztahu mezi strukturou molekuly a její funkcí, která je významná dodnes. Trojrozměrný model struktury hemoglobinové molekuly sestavil r. 1960 John Cowdery Kendrew (Nobelova cena za chemii 1962). Model dovolil interpretaci fyzikálně-chemických a fyziologických změn vyvolaných mutacemi a umožnil odvodit význam původních aminokyselin pro strukturu a funkční vlastnosti hemoglobinové molekuly.

Takové přístupy při výzkumu drepanocytózy použili M. F. Perutz, B. Wischner a S. Edelstein, kteří se pokusili určit molekulární mechanizmus, jímž dochází k polymeraci hemoglobinu S. Jejich výzkumy vedly zároveň k vzniku představ o látkách, které by polymeraci mohly zabránit. K těm se dospělo na základě pokusů in vitro, jež kromě jiných uskutečnili v New Yorku R. M. Bookchinem, R. a R. Beneschovi a ve Francii M. D. Rhoda, kteří se zabývali vazbami a vztahy uvnitř molekuly hemoglobinu S a ostatních abnormálních hemoglobinů, zvláště těch, které vedou k polymeraci. Polymerace je důsledkem vzniku četných slabých vazeb, které se vytvářejí mezi řetězci beta sousedních molekul HbS. Slabost vazeb vysvětluje, proč přítomnost normálního hemoglobinu v množství, které nacházíme u heterozygotů a které převyšuje obvykle množství HbS, brání vzniku polymeru. Molekuly normálního hemoglobinu, jež se nacházejí mezi molekulami HbS, nedovolí vytvoření vazeb nezbytných pro polymeraci. To platí stejně i pro hemoglin F (HbF, foetus = plod), který se vyskytuje v krvinkách plodu a chrání ho před rozvojem drepanocytózy.

Intenzivně se začaly hledat látky, které by měly podobný účinek. Na prvním místě to byl kyanát (1978) a látky jako cysteamin (1976), nebo aspirin, zkoušený r. 1973. Řada těchto látek byla úspěšná in vitro a dokázala zamezit polymeraci. Jejich použití jako léku však nebylo možné. Třeba proto, že bylo obtížné dosáhnout vhodné koncentrace uvnitř krvinek, aniž by byly toxické pro ostatní tělo.

V současnosti jedna z látek, označená 12C79, kterou vyvinuly společnosti Burroughs a Wellcome r. 1991, se zdá být vhodná pro léčbu a je zkoušena ve Spojených státech. Bohužel i v jejím případě je použití vzhledem k toxicitě omezeno na kritické situace - např. trombotickou příhodu s použitím mimotělového oběhu, kdy lze působit na krev izolovanou od pacientova těla. Ve srovnání s jinými léčebnými strategiemi je manipulace s proteiny in vivo záležitostí nesmírně obtížnou. Pokus o zlepšení cirkulace cévními rozšiřovači rovněž zcela selhal. Ve Spojených státech se pokoušeli ovlivnit tvar červených krvinek působením na osmotický tlak bílkovin plazmy. Jiný směr se opíral o nálezy E. Kleihauera (1957), který pozoroval zvýšenou přítomnost fetálního hemoglobinu u některých drepanocytóz. Řada prací in vitro uskutečněných po r. 1974 ukázala, že podobně jako hemoglobin A i fetální hemoglobin brzdí polymeraci a tak vznikla idea zvýšení množství fetálního hemoglobinu jako terapeutický zákrok. Mezi prvními uskutečněnými byl přístup farmakologický. Léčení pacientů s maligními hemopatiemi azacytidinem vedlo k zvýšení fetálního hemoglobinu. První terapeutické protokoly se opět objevily ve Spojených státech, počínaje r. 1988 (S. Charache, John Hopkins Univ.). Účinek byl nejistý, ale zřetelný. Později začala být dávána přednost hydroxyurei, kterou v Bostonu zavedl Daniel Nathans r. 1984 s menší toxicitou a podobným efektem. Předpokládá se, že pro tvorbu HbF v dospělosti existuje genetická predispozice, ale příslušné, ji podmiňující geny nebyly ještě identifikovány, ostatně nemusí jít o geny, ale o strukturu regulačních sekvencí. Tato pozorování podnítila rozvoj studia mechanizmů kontroly exprese genů hemoglobinových řetězců. Paralelně se rozvíjely i práce epidemiologické, které ukázaly, že drepanocytózy v Indii a Saúdské Arábii probíhají mnohem neškodněji než v Africe. A ukázalo se, že v těchto zemích je také větší množství osob s vrozenou predispozicí k syntéze fetálního hemoglobinu v dospělosti.

K charakterizaci těchto populací byly použity sekvence DNA sousedící s kódujícími oblastmi genů řetězců alfa a beta. V této době byla určena sekvence genu pro řetězec beta a Y. W. Kan v San Francisku zjistil interindividuální rozdíly v nekódující části beta řetězcového genu. U osob s drepanocytózou se tato sekvence lišila od osob normálních a tento rozdíl byl identifikovatelný restrikčním enzymem HpaI štěpícím DNA v této oblasti. Tehdy se začíná používat název restrikční haplotypie, který ne zcela vhodně splývá s klasickým genetickým pojmem téhož termínu. Vlastnost štěpitelnosti DNA určitým restrikčním enzymem na daných místech je zcela obecná a nesouvisí přímo s patologickým procesem, v našem případě s drepanocytózou. Lze však vytipovat určité haplotypy, které se převážně nacházejí u osob s drepanocytózou a s produkcí fetálního hemoglobinu. Y. W. Kan tak se svými pozorováními stojí na začátku DNA–diagnostiky, její nepřímé metody, která se opírá o sledování interindividuální variability DNA.

Byl to současně začátek antropologické discipliny, kterou bychom mohli zařadit do biochemické antropologie a vlastně do antropologie genomové. Haplotypy beta–globinové oblasti, do které spadají kromě genu pro řetězec beta ještě další geny a pseudogeny i s vmezeřenými nekódujícími sekvencemi (viz schéma), mohou být využity k charakterizaci genomu na populační úrovni. A lze je použít k interpretaci populačních procesů, které se na současném výskytu drepanocytózy podílely. Bylo to v první řadě poznání, že zdrojem bylo několik mutací, které se objevily na různých místech (geograficky) a z nich se rozšířily generačním přenosem. K otázce proč se mohla mutace globinového řetězce beta rozšířit natolik, že dnes je nositelem genu této molekulární nemoci mnoho milionů osob, již také máme populačně genetické vysvětlení v podobě preference heterozygotů. Drepanocytóza se rozšířila hlavně v končinách zachvácených endemickou malárií, kde nositelům mutovaného genu, v jejichž krvinkách se malarická plazmodia nemohou vyvíjet, poskytovala výhodu proti osobám s normálním hemoglobinem. Drepanocytózu jako tvarovou zvláštnost erytrocytů můžeme pozorovat i u jiných savců, např. u jelenovitého mundžaka, kterého kdysi chovala i pražská zoologická zahrada a jehož krvinky jsme úspěšně podvrhovali při ukázkách studentům. V jeho případě se však nezdá, že by šlo o chorobný příznak. Při troše fantazie si lze představit, že i u člověka by se výskyt hemoglobinu S (HbS) mohl stát tak obecným, že bychom ho považovali za normální hemoglobin, stejně jako považujeme za normální neschopnost syntézy vitaminů.

Studium haplotypů, jejich přenosu z rodičů na dítě a jejich svázanost se „zdravým“ nebo s “nemocným“ genem umožnilo zavedení prenatální diagnostiky. Její současná podoba využívá však již přímou diagnostiku DNA a opírá se o přímý důkaz přítomnosti normální sekvence GAG nebo mutované GTG (kodon 6), ať už třeba pomocí alelně specifické PCR, nebo hybridizací. Prediktivní medicína, jejíž součástí je i prenatální diagnostika, je nosným heslem současného lékařství a ne již pouze deklarovaným, ale právě díky DNA–diagnostice plně reálným cílem.

Jak vypadá oblast osídlená rodinou globinových genů skupiny beta? Nejdříve sám gen pro řetězec beta. Protože globiny jsou tvořeny polypeptidovými řetězci nevelké délky – beta-globin 146 aminokyselinami, nejsou ani kódující sekvence beta-globinového genu dlouhé. Bráno čistě teoreticky, mělo by stačit 147 kodonů, tj. 146 kódujících aminokyseliny + 1 stopkodon, přepočteno na počet nukleotidů 147x3=441. Skutečná délka je však větší, neboť musíme připočíst další, pro funkci genu nezbytné sekvence, včetně intronů. I tak však v zástupu genů seřazených podle velikosti bude beta-globinový gen stát mezi těmi nejmenšími (asi 1600 nukleotidů). Zralá mRNA, používaná k translaci, je pak skutečně jen o málo delší než námi vypočtená délka – o krátký začátek a o něco delší zakončení (celkem asi 700 nukleotidů). Rodina globinových genů skupiny beta sestává nejméně z 5 funkčních genů a jednoho pseudogenu a je seřazena tak, že první ve směru 5’→ 3’ leží embryonální (epsilon) a fetální geny (gamaG a gamaA), pak následuje pseudogen beta, gen pro globinový řetězec delta, podílející se společně s řetězcem alfa na vzniku "dospělého" hemoglobinu A2, a konečně posledním v řadě je gen pro řetězec beta. Unitř těchto genů a mezi nimi bylo indentifikováno mnoho polymorfních restrikčních míst s charakteristickým polymorfizmem typu RFLP (restriction fragment length polymorphism), ale i polymorfizmy typu VNTR a STR (variable number of tandem repeats, short tandem repeats). K haplotypizaci jsou však používány většinou jen některé, obvykle 5, neboť se ukázalo, že ze všech možných byla zatím identifikována jen část haplotypů a zbylé, pokud vůbec existují, jsou patrně velmi vzácné. Studium haplotypů, které stálo na samém začátku prenatální DNA–diagnostiky hemoglobinopatií, však také ukázalo, že ohnisek, ze kterých se mutace betaS  rozšířily, bylo nejméně 5, čtyři v Africe a jedno v Asii.

Když už nám otázky pochopení podstaty onemocnění, příčiny jeho rozšíření a diagnostické přístupy začaly být poměrně jasné, vrátíme se ještě jednou k léčebným vyhlídkám.

Jaké jsou současné možnosti terapeutických zásahů? Je možné toto onemocnění vyléčit a vymazat z mapy světa? Protože jde o chorobu dědičnou, způsobenou mutací v části genu ovládající strukturu (aminokyselinové složení) globinového řetězce, který je zcela nezbytný pro řádnou funkci hlavního hemoglobinu dospělých, jsou nasnadě dva přístupy. Jednak preventivní, kdy určitým způsobem budeme ovlivňovat pravděpodobnost narození homozygotního nositele HbS. Nejjednodušším způsobem by bylo ovlivnění výběru partnerů tak, aby jeden z rodičů byl vždy homozygotem pro normální hemoglobin. Realizace této představy je značně problematická. Mnohem realističtější, ale také ne již tak nekrvavá je prenatální diagnostika s možností přerušení těhotenství v případě plodů ohrožených drepanocytózou. Jsou-li oba rodiče heterozygoty, a těch je v některých oblastech 30 i více procent všech domorodých obyvatel, a pravděpodobnost narození homozygotního dítěte 0,25, pak to z populačního hlediska znamená, že při rodičovských párech tohoto typu [0,3 x 0,3 = 0,09 (9 %), 0,09 x 0,25 = 0,0225] bude riziko narození cca 2 %. Jiným faktem ovlivňujícím rozhodování o tomto způsobu řešení je skutečnost, že průběh a tíže onemocnění značně kolísají.

Druhý přístup, při němž akceptujeme existenci chorobného stavu nebo alespoň předpoklad k němu a do něhož jistě patří i již zmíněné snahy o farmakologické ovlivnění drepanocytózy, se snaží pokud možno dlouhodobě působícími zásahy průběh a projevy onemocnění tlumit, případně jim zcela zabránit. Jednou z již úspěšně vyzkoušených cest u mnoha dalších chorob je transplantace kostní dřeně. Zmínkou o ní jsme otevřeli natolik širokou a otázkám zde probíraným vzdálenou problematiku, že se vzdáme jejího i jen nepatrně podrobnějšího rozboru. Jejímu použití brání kromě problémů odborných hlavně důvody ekonomické. Jde totiž o léčebnou metodu, která je poměrně riskantní, a tedy odůvodnitelná tam, kde její nepoužití má vždy mnohem horší vyhlídky. Krom toho je natolik nákladná, že se sotva kdy stane použitelnou u chorob, které postihují větší množství osob.

Musíme se rovněž zmínit i o možnostech tzv. genové terapie, o které se v poslední době často mluví a která právě zažívá experimentální boom. Dočkala se i klinických pokusů, pochopitelně i odsuzovaných, a tak poněkud připomíná situaci kolem prvních transplantací srdce. Z tohoto hlediska se pro genovou terapii drepanocytóza zdá být tvrdším oříškem než jiná onemocnění, i např. talasémie. Nejde totiž jen o pouhé vnesení genetické informace kamkoliv, ale mělo by být cílené a pokud možno se zachováním přirozených regulačních vztahů. Ideální řešení v podobě opravy poškozeného genu je stále jen vzdálenou touhou. Ne že bychom geny opravit nedokázali, v experimentu na menších a méně složitých genomech to již umíme, ale lidská buňka vyžaduje nejen ještě o něco propracovanější metodiku a techniku s menším rizikem neúspěchu nebo nepředvídaných komplikací, ale i vyřešení etických problémů, které bude asi mnohem svízelnější než získání potřebných dovedností. 1)

Literatura

J. Rosa: L’ Anémie falciforme. La Recherche 24, 576-583, 1993.
Y. W. Kan et al.: Polymorphism of the DNA sequence adjacent to the beta globin structural gene: Relationship to sickle mutation.
Proc. Natl. Acad. Sci., USA 75, 5631, 1978.
D. Weatherall: Bone marrow transplantation for thalassemia and other inherited disorders of hemoglobin. Blood. 80, 1379, 1992.
V. M. Ingram: The hemoglobins in genetics and Evolution. Columbia Univ. Press, New York 1963.
G. R. Honig and J. G. Adams III: Human hemoglobin genetics. Springer Verlag, New York 1986.
G. Stamatoyanopoulos et al.: The molecular basis of blood diseases. W. B. Saunders comp. Philadelphia. 1992.

Poznámky

1) O šíři významu, který si hemoglobin ve vědeckém světě vydobyl, nesvědčí jen počet Nobelových cen s ním nějakým způsobem spojených, ale i to, že hemoglobinisté mají svůj vlastní časopis HEMOGLOBIN (letos vychází již 18. svazek).
OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Nemoci člověka

O autorovi

Radim Brdička

Prof. MUDr. Radim Brdička, DrSc., (*1933) vystudoval Fakultu všeobecného lékařství Univerzity Karlovy v Praze a po dvouletém období, kdy se věnoval medicíně, pracoval 29 let v Ústavu lékařské biologie a genetiky 1. lékařské fakulty v Praze. Vedle učitelských povinností se věnoval studiu laboratorních potkanů a posléze se začal zabývat i lidskou molekulární genetikou. V roce 1989 přešel do Ústavu hematologie a  krevní transfuze a Ústavu experimentální medicíny AV ČR, v. v. i., odkud odešel v roce 2011 do důchodu. Nyní je na tzv. volné noze, s občasnou funkcí konzultanta firmy BIOGEN Praha, s. r. o., kterou kdysi pomáhal založit. Vedle krátkých pracovních pobytů v zahraničí pracoval dva roky v Římě v Istituto Superiore di Sanitá. Svou pozornost zaměřuje na proměnlivost lidského genomu. Je nositelem medaile J. E. Purkyně za celoživotní dílo.

Doporučujeme

Pěkná fotka, nebo jen fotka pěkného zvířete?

Pěkná fotka, nebo jen fotka pěkného zvířete?

Jiří Hrubý  |  8. 12. 2024
Takto Tomáš Grim nazval úvahu nad svou fotografií ledňáčka a z textové i fotografické části jeho knihy Ptačí svět očima fotografa a také ze...
Do srdce temnoty

Do srdce temnoty uzamčeno

Ladislav Varadzin, Petr Pokorný  |  2. 12. 2024
Archeologické expedice do severní Afriky tradičně směřovaly k bývalým či stávajícím řekám a jezerům, což téměř dokonale odvádělo pozornost od...
Vzhůru na tropický ostrov

Vzhůru na tropický ostrov

Vojtěch Novotný  |  2. 12. 2024
Výpravy na Novou Guineu mohou mít velmi rozličnou podobu. Někdo zakládá osadu nahých milovníků slunce, jiný slibuje nový ráj na Zemi, objevuje...