Knokautovaná myš – druhé kolo

Pod tímto názvem se v červencovém čísle Science (Vol. 265, str. 26) objevil komentář k novému úspěchu molekulární biologie – metodě umožňující tkáňově specifické umlčení určitého genu. Standardní genové knokautování (termín knockout se v odborné literatuře běžně používá ve významu umělé inaktivace určitého genu nebo genů) se provádí tak, že se v embryonálních kmenových buňkách pomocí tzv. homologní rekombinace zamění funkční forma genu za formu nefunkční a tak je vybraný gen specificky umlčen. Embryonální kmenové buňky jsou schopny se po vpravení do raných myších embryí dělit a spolu s buňkami embrya vytvářejí diferencované tkáně a orgány. Narozená myš je pak vlastně mozaikou buněk (včetně pohlavních), z nichž některé obsahují normální a jiné neaktivní formu genu. Tyto „mozaikové“ myši se pak kříží a při troše štěstí je spermií s inaktivovaným genem oplodněno stejně postižené vajíčko a jako výsledek tohoto spojení se rodí myš, která má ve všech svých buňkách v obou chromozomálních sadách sledovaný gen v neaktivní formě.

Metoda přípravy těchto tzv. knokautovaných myší byla vyvinuta ke sledování funkce genů na úrovni organizmu a byla použita již v několika desítkách případů. Má však jedno velké omezení – umlčení některých genů je smrtelné již ve stadiu embrya, popřípadě v raných stadiích postfetálních. Na tento problém narazili též autoři článku v Science. Chtěli studovat vliv DNA polymerázy ß na buňky imunitního systému a při standardním knokautování zjistili, že tento enzym je nezbytný pro myší ontogenezi – embrya umírala dříve, než se začaly diferencovat objekty zájmu – buňky T a B imunitního systému. Cestou ze slepé uličky je metoda tkáňově specifického genového knokautu, která využívá schopnost enzymu Cre rekombinázy bakteriofága P1 vyštěpit vlákno DNA mezi dvěma krátkými úseky zvanými loxP. Tento enzym je schopen odstranit z vlákna DNA libovolný úsek (pokud je obklopen po obou stranách loxP), vlákno opět spojit a na původním místě zanechat jen jednu sekvenci loxP a – což je velmi důležité – celý systém funguje nejen v bakterii, ale i v rostlinách a živočiších. Nezbytným předpokladem tkáňové specifity vyštěpení úseku DNA obklopeného sekvencemi loxP je zajištění produkce rekombinázy Cre jen v těch buňkách, v nichž chceme gen umlčet.

Celá tato metoda zahrnuje velký počet kroků a využívá celý bohatý arzenál genového inženýrství. Kýženým výsledkem je stav, kdy myší embryo v každé své buňce obsahuje gen, který chceme tkáňově specificky odstranit obklopený sekvencemi loxP a gen pro rekombinázu Cre regulovaný tak, že se tento enzym objevuje jen v požadovaných buněčných typech. V případě DNA polymerázy ß se podařilo zajistit produkci rekombinázy Cre specificky jen v T-buňkách a zjistit, že tento enzym není nezbytně nutný pro diferenciaci a život T-buněk. Za důležitější než samotný výsledek považují sami autoři fakt, že celá metoda funguje a je použitelná v řadě modifikací k řešení problémů do nedávné doby zcela neřešitelných.