Mikroskopie, kde byste ji nečekali

Vidět na vlastní oči je od nepaměti jedním z klíčů k pochopení záhad přírody a světa kolem nás. Uvěřit, že lidské tělo se skládá z jednotlivých buněk ne nepodobných těm, které tvoří třeba žížalu, vyžaduje obrovskou míru představivosti a důvěry. Až do té doby, než je poprvé uvidíte, třeba v mikroskopu. Představa, že každá taková buňka žije vlastní život, pracuje, dělí se a všechno to řídí kaskáda zdánlivě náhodných pohybů jakýchsi molekul, zní naprosto bláznivě až do okamžiku, kdy tyto pohyby můžeme pozorovat. Otázka, jestli i kolem ostatních hvězd obíhají planety, trápila lidstvo od doby, kdy pochopilo, že na jedné takové planetě sedí, až do chvíle, kdy tyto planety dokázalo vidět. Protože vidět znamená uvěřit.

Mikroskopii lze označit za matku přírodních věd, která od sklonku 16. století, kdy otec a syn Janssenovi sestavili první mikroskop, pomáhá rozkrývat nevídané kolem nás. Je až ne­uvěřitelné, čím si tento výzkumný obor prošel a s jakou vervou drží dynamiku průlomových objevů už přes čtyři sta let. Již v 17. století Anton van Leeuwenhoek pomocí svých mikroskopů pochopil složení krve a jako první pozoroval nejmenší živé organismy, kterým dnes říkáme bakterie, jako rozmazané pohyblivé tečky. Na konci století 19. bylo jasno. Ernst Abbe ukázal, že optická mikroskopie neumožňuje zobrazit menší detaily, než je přibližně polovina vlnové délky světla. V zásadě tím potvrdil, že o moc lepší než v té době 200 let staré pozorování van Leeuwenhoeka to nikdy nebude. Hotovo, jedna uzavřená vědní disciplína, ve které lidstvo poznalo už vše, co poznat šlo. Jenomže vědci milují, když se řekne, že něco nejde. Následovala smršť objevů a Nobelových cen. Namátkou uveďme zobrazování průhledných vzorků, elektronovou mikroskopii, konfokální mikroskopii, tunelovací mikroskop, laserový rastrovací mikroskop, fluorescenční mikroskop, superrozlišovací mikroskopii, fluorescenční proteiny nebo kryogenní elektronovou mikroskopii. Některé z těchto metod nám umožnily pozorovat strukturu hmoty až na úroveň rozložení jednotlivých atomů. Dlužno podotknout, strukturu obvykle zcela mrtvé hmoty, často zmražené a usazené ve vakuu. Pokud chceme vidět, jak děje fungují a jak do sebe zapadají ozubená kolečka jednotlivých přírodních procesů, obzvláště v živých organismech, omezujeme se obvykle na pozorování nedestruktivní, které zachovává přirozené vlastnosti pozorovaného vzorku. A přesně tuto oblast pozorování v mikroskopii zaujímá mikroskopie optická, tedy využívající běžné, obvykle viditelné světlo, a v té pořád omezuje Abbeho limit obraz malých bakterií na rozmazané pohyblivé tečky.

Podívejme se podrobněji, co to znamená, když něco, ať už s mikroskopem, nebo bez mikroskopu, vidíme. Když světlo dopadne na vzorek, tedy na to, co chceme pozorovat, mohou se stát tři věci: světlo se může odrazit jiným směrem (říkáme tomu rozptyl), může být pohlceno (neboli absorbováno) a může se vyzářit. A to je vše. Po stovky let badatelé spoléhali na dva z těchto procesů – absorpci a rozptyl. Tedy buďto pozorovali potemnělý stín v prošlém světle, nebo jakési kontrastnější prozáření z důvodu rozptýleného světla. Až na konci 20. století se ke slovu dostala fluorescenční mikroskopie, tedy mikroskopie pozorující světlo ze vzorku vyzářené. To není samo sebou. Málokteré vzorky samy od sebe svítí. Svítí některé medúzy, ale většina našich čtenářů zcela jistě nesvítí, nebo svítí jen velmi málo (viz článek Michala Cifry). Proto se ke vzorku zpravidla musí přidat malé množství svítících látek, fluoroforů, které vzorek označí, a někdy se dají takové svítící molekuly dokonce vypěstovat přímo ve vzorku. Fluorescenční mikroskopie přinesla zásadní zjednodušení v tom, že se přestáváte dívat na vzorek v jeho nepřeberné složitosti, ale svítící značkou označíte pouze tu část, kterou chcete pozorovat a pochopit. Avšak ani tento svítící, fluorescenční obraz v jakkoli dobrém mikroskopu neukázal svět v ostřejším detailu. Rozklíčování složité mašinerie molekulárních procesů, která žene naše životy kupředu, tak zůstávalo v nedohlednu.

Jeden z velikánů světové fyziky, Erwin Schrödinger, byl ještě v roce 1952 skálopevně přesvědčen, že nikdy nebudeme experimentovat s objekty, jako je jedna molekula nebo atom, že tento koncept je čistě doménou myšlenkových pokusů. Už jsem zmínil, že vědci milují, když se řekne, že něco nejde. A tak v roce 1989 americký vědec W. E. Moerner, pozdější nositel Nobelovy ceny, publikoval stať o optickém zobrazení jednotlivých fluorescenčních molekul. Když se následně podařilo tyto fluorescenční molekuly rozblikat a navíc zobrazit v živých buňkách, nemluvilo se dalších dvacet let v optické mikroskopii skoro o ničem jiném než o superrozlišovací mikroskopii. Problém optického rozlišení omezeného Abbeho difrakčním limitem tkví v tom, že když vidíte v mikroskopu rozmazaný flek velikosti poloviny vlnové délky, nevíte, na jak velký objekt se díváte ani jaký má tvar. Ale pokud víte, že se díváte na jednu jedinou malou molekulu a můžete ji považovat za jednu jedinou svítící tečku někde uprostřed toho rozmazaného fleku, pak z těchto postupně zobrazených teček můžete sestavit celý obraz vzorku v mnohem vyšším detailu, než přímo v mikroskopu vidíte. Superrozlišovací mikroskopie je jednoduše fenomenální počin, jednoduchý, snadno pochopitelný, zdánlivě popírající základní principy fyziky a ukazující úchvatné detaily života kolem nás. Prostě sexy. Pro lidstvo to bylo, jako když dítě poprvé vezme do ruky lupu a zjistí, že mravenec má kusadla.

Studentka Kateřina Jiříková v laboratoři nanooptiky v Ústavu fotoniky a elektroniky. Optický stůl nese experimentální systém ultracitlivého mikroskopu.

A tak si vědci postupně zvykli na to, že musejí pečlivě volit, co si ve svém vzorku označkují a co budou ve vysokém detailu studovat. Dávají si tím sice na oči klapky, přes které nevidí celou složitost pozorovaných dějů, a to, co neoznačí, v obrázku prostě není, ale bez fluorescenčních značek se superrozlišovací mikroskopie přece dělat nedá, že?

Takže se zdálo, že opět „něco nejde“. Že ne? Když jsem před více než deseti lety poprvé na konferenci ukazoval data zobrazující jednotlivé molekuly proteinů bez použití fluorescenčních nebo jakýchkoli jiných značek, vzbudilo to poprask. V podstatě mi nikdo nevěřil, alespoň z těch, co se odvážili ozvat. Byl to zvláštní pocit zadostiučinění, být jediným člověkem na světě, který věděl, že to jde, a uměl to postavit. Dnes už tomu věří, dokonce si takový přístroj může kdokoli koupit a spočítat si molekuly ve svém vzorku jednu po druhé. Experiment, který mně trval tři roky, může udělat za deset minut.

Zobrazení jediné molekuly biologické hmoty byl nepochybně průlom. Ale na příkladu prvního zobrazení fluorescenční molekuly jsem zmínil, že pro revoluci v optické mikroskopii byly potřeba ještě minimálně další dvě věci – ty molekuly rozblikat a zobrazit v živé buňce. To první se nám podařilo až po mém návratu do Čech v našem malém výzkumném týmu v Ústavu fotoniky a elektroniky. Všimli jsme si, že je užitečné dívat se na změny pozorovaných molekul, když dělají něco zajímavého, třeba když se na chvíli zastaví, aby provedly svou oblíbenou chemickou reakci. Díváte-li se na tisíce volně proplouvajících molekul, tak tím, jak jsou všechny trochu pohybem rozmazané, splynou v dokonale hladký a neměnný obraz. Jakmile se ale jedna z těch molekul zastaví, obraz se malinko změní. Ne moc, ale porovnáte-li obraz před zastavením a po zastavení, můžete si na okamžik všimnout změny. Říkejme tomu bliknutí. To bliknutí vychází z jednoho bodu a je přesně tam, kde se něco děje. A protože chemické reakce neprobíhají všechny najednou, ale v náhodném sledu jedna po druhé, můžeme s dostatečnou rychlostí snímání zachytit skoro všechny tyto změny. Tohle už ale není žádné šolichání, tady jsme se od populárně-historického úvodu dostali k tvrdé vědě na hranici dnešního poznání, vědě plné nezdarů a občasných zázračných pozorování, prozření a dlouhých odboček.

Pozorovat mašinerii všech jednotlivých molekul v tak komplikované soustavě, jakou je živá buňka, nám pravděpodobně ještě chvíli potrvá. Jednak proto, že těch molekul může být opravdu hodně, a pak všechny ty jednotlivé chemické reakce probíhají až tisíckrát rychleji, než jsme zatím schopni zaznamenat. Ale dobrá zpráva je, že jsme dosud nenarazili na žádné principiální omezení, kde by nám příroda zakazovala náš vysněný experiment udělat. Omezení jsou technická, elektronika je pomalá, vzorek se přehřívá a tak podobně. Ve vědě jsou ovšem technická omezení výzvou k řešení a obvykle se prací a zkušeností dají překonat.

Zajímavým příkladem je naše hledání třetího rozměru. Zatímco náš svět je třírozměrný, obrázek z mikroskopu je zpravidla placatý. Mikroskopie dnes už zná postupy, jak zaznamenat celou hloubku mikroskopické scény, jenom v našich mikroskopech bylo využití těchto obvyklých postupů komplikovanější. Zatímco obrazovou informaci v mikroskopu lze zachytit jako rozložení intenzity světla kamerou, ten třetí rozměr pozorovaného vzorku je propsán do tvaru vlnoplochy (obvykle mluvíme o fázi světelné vlny). Tu sice není jednoduché změřit, ale lze ji měnit, ovlivňovat fázovými modulátory. Prostorové fázové modulátory se používají například v astronomii. Světlo ze vzdálené hvězdy k Zemi doputuje zpravidla jako dokonalá rovinná vlna, jejíž vlnoplocha nevykazuje prakticky žádné zakřivení. To se ale změní průchodem atmosférou a fázové modulátory umožňují tyto změny opravit. Problém byl v tom, že dostupné fázové modulátory pro náš mikroskop nebyly ani zdaleka dostatečně rychlé, ani stabilní, a museli jsme pro svá měření vyvinout modulátory zcela nové. Ukazuje se, že tyto nové modulátory fáze by mohly s výhodou najít uplatnění nejenom v našich extrémně citlivých mikroskopech, ale mohly by se vydat i zpátky ke kořenům a vylepšit astronomické dalekohledy budoucnosti. Protože fyzika je jenom jedna a dalekohled je v podstatě jenom takový mikroskop na galaxie.

Výzkumný tým nanooptiky rozvíjí v Ústavu fotoniky a elektroniky moderní zobrazovací metody od roku 2016. Vyvíjíme nové experimentální metody a snažíme se odpovídat na základní otázky fungování přírody kolem nás. Pochopení molekulárních mechanismů živých soustav je jednak fascinující dobrodružství, jednak nabízí odpovědi v případě, že některé tyto mechanismy přestanou fungovat. Naše práce stojí na úsilí studentů, doktorandů a ­postdoktorandů odhodlaných zkusit to, o čem všichni předpokládají, že nejde. Je to příležitost srovnatelná s prvovýstupem na dosud nezdolanou horu, pro který nemá odvahu každý, ale ti, kteří se na tuto cestu vydají, získávají smysl života překračující hranice v nás i mezi státy. Díky nim i po 430 letech ve službě dobrodružství optické mikroskopie pokračuje.