Minimozky ve zkumavce

Cerebrální organoidy, nebo také „minimozečky“, jsou trojrozměrné kuličky vypěstované v laboratoři z lidských pluripotentních kmenových buněk, které v průběhu svého růstu poměrně dobře rekapitulují vývoj a organizaci lidského mozku. Slouží jako model pro studium neurologického vývoje a procesů vzniku chorob, které jsou pro lidský nervový systém jedinečné.

Vývoj , organizace a funkce lidského mozku fascinovaly vědce po staletí. Ale protože získat lidskou mozkovou tkáň pro experimentální studium je obtížné jak z praktických, tak z etických důvodů, tradičně se pro výzkum v neurovědách používají zvířecí modely a buněčné kultury. Díky zvířecím modelům, mezi které patří zejména hlodavci (ale i primáti a další modelové organismy), se podařilo dobře popsat různé funkce centrální neurální soustavy (CNS), avšak pochopení specifik vývoje a funkcí lidského mozku bylo značně limitované. Studie lidského mozku se tedy omezily na pozorování tkání získaných po smrti pacienta, na analýzu buněk odvozených z lidských mozkových nádorů a vzácně i z mozku a míchy dobrovolných dárců. Zdroje těchto buněk však byly omezené a bez možnosti jejich širšího využití.

Zásadní průlom ve využití buněčných kultur v neurobiologii nastal v roce 1998, kdy byly vytvořeny první linie lidských embryonálních kmenových buněk. V časopise Science publikovali James Thomson a kol. studii, ve které se jim podařilo vytvořit kmenové buňky z pět dní starého lidského embrya (ve vývojovém stadiu blastocysty). Tyto buňky jsou schopny za určitých podmínek vytvořit jakoukoliv dospělou buňku lidského těla, a mohou tak být využity jako model embryonálního vývoje, např. vývoje lidských neuronů. V roce 2006 se pak uskutečnil další krok vpřed. Dva japonští vědci (Shinya Yamanaka a jeho student Kazutoshi Takahashi) v časopise Cell představili tvorbu tzv. indukovaných pluripotentních kmenových buněk (anglicky induced pluripotent stem cells – iPSCs), které jsou svými vlastnostmi podobné těm embryonálním. Tato metoda pomocí jednoduché genetické manipulace totiž umožňuje tvorbu iPS buněk téměř z jakéhokoliv typu dospělé tkáně. Představují proto velmi cenný nástroj v základním i klinickém výzkumu, neboť iPS buňky mohou být odvozeny nejen od zdravých dárců, ale i od pacientů.

Po derivaci prvních embryonálních a následně i indukovaných pluripotentních kmenových buněk byly vyvinuty různé přístupy pro jejich cílenou specializaci (diferenciaci). V dnešní době je tak již možné vytvořit téměř jakýkoliv buněčný typ dospělého organismu in vitro včetně různých druhů neuronů a jejich podpůrných buněk (astrocytů a oligodendrocytů). Diferenciace in vitro probíhá zejména pomocí různých přídavků do kultivačního média, které buňkám dodávají ty správné vývojové signály. Buňky pak zpravidla rostou na Petriho misce v 2D kultuře – tj. přisedlé na dně misky, kde je lze dobře pozorovat v průběhu růstu i diferenciace a také s nimi jednoduše manipulovat. Často jsou také poměrně homogenní, tj. na Petriho misce po efektivní diferenciaci vzniká buď jenom jeden, nebo jen několik málo buněčných typů, které lze lehce charakterizovat i analyzovat. Živočišné tkáně (a zejména lidský mozek) jsou však tvořeny širokým repertoárem buněčných typů propojených mezibuněčnou hmotou a uspořádaných v komplexních 3D strukturách, které ovlivňují identitu a funkci buněk. Tuto organizaci tedy nelze dobře rekapitulovat pomocí tradičních dvojrozměrných buněčných kultur, a bylo proto nutné vymyslet nový přístup, který by trojrozměrné podmínky namodeloval lépe.

Fluorescenční značení průřezu cerebrálním organoidem. Modrou barvou jsou značena jádra všech buněk, červeně všechna nervová vlákna, zelenou pak jen nezralé neurony. Průnik zelené a červené se na obrázku jeví žlutě, je tedy možné říct, že z pohledu maturace neuronů jde o poměrně nezralý „minimozeček“.Snímek Tereza Váňová

K vytvoření takového buněčného modelu in vitro, který by byl podobný vývoji CNS in vivo, vedlo zavedení a zlepšení metod tzv. 3D kultivace. Na rozdíl od zmíněných 2D podmínek se při 3D kultivaci jednoduše buňky přinutí „nepřisednout“ na povrch Petriho misky. Ztráta kontaktu s povrchem misky u některých typů buněk indukuje shlukování a tvorbu malých „kuliček“ (sfér nebo tělísek), které si uvnitř vytvoří specifické mikroprostředí pro další růst a vývoj. Již dlouho je v neurobiologii známa 3D kultivace tzv. neurosfér. Tyto kuličky buněk dokážou vytvořit ideální prostředí zejména pro růst různých typů neurálních kmenových buněk, jsou ale neorganizované a dorůstají do velikosti jenom několika stovek mikrometrů, pak se jejich růst zastaví. V biologii iPS buněk zase existují tzv. 3D embryoidní tělíska. Tento systém kultivace se často využívá pro nespecifickou indukci diferenciace kmenových buněk, a stojí tak na počátku různých diferenciačních protokolů, od buněk srdeční svaloviny přes retinu až po neurony. Jde opět o pouhých několik desítek až stovek mikrometrů veliké kuličky se specifickým mikroprostředím, které je ale již možné zásadně ovlivnit v jejich specializaci. Možná i proto nepřekvapí, že tvorba embryoidních tělísek je i prvním krokem na cestě k minimozečkům.