Molekuly na obzoru

Nové techniky fluorescenční a konfokální mikroskopie posouvají možnosti v pozorování vnitrobuněčných struktur. Optická mikroskopie byla po dlouhou dobu limitována rozlišením definovaným Abbeho difrakčním limitem.¹⁾

V nedávné době byl tento limit překonán pomocí několika superrezolučních mikroskopických technik, díky nimž se posouváme na úroveň rozlišení několika desítek nanometrů, a tím ještě blíže k molekulární úrovni života.

Velkým posunem v mikroskopii bylo uvedení konfokálního mikroskopu. Konfokální mikroskop používá lasery, které slouží k excitaci fluorescence v rovině ostrosti, a vše, co je nad i pod touto rovinou ostrosti, je odstraněno. Tento tzv. „optický řez“ může být optimalizován pomocí konfokální štěrbiny (pinhole). U takovýchto systémů se používá skener, který laserovým bodem budí excitaci pouze v daném bodě a skládá obraz řezu. Fluorescenční signály jsou zachyceny elektronickými detektory. Výsledný obrázek má díky takovému procesu vyšší rozlišení. Sofware je poté schopný poskládat jednotlivé optické řezy do 3D obrázku. Ten je vhodnější pro rekonstrukci struktur, tkání a dalších biologických preparátů. Rozlišení, které je možné takto dosáhnout, je řádově okolo 200 nm.

Při použití konfokálních mikroskopů stále narážíme na omezení definované difrakčním limitem.¹⁾ Některé systémy tento limit obcházejí použitím matematických, korelačních mikroskopických metod. Na světě se však objevila ryze fyzikální metoda, kterou je možné tento limit prolomit. Tato metoda se nazývá STED (Stimulated emission depletion). Za nejenom tento objev byla udělena Nobelova cena Ericu Betzigovi, Stefanu W. Hellovi, Williamu E. Moernerovi za chemii v roce 2014. Tato superrezoluční technika je založená na principu zhášení fluorescence. Základem je použití laserů pro buzení fluorescence podobně jako u konfokálních mikroskopů. I zde se skenuje bodovým skenerem plocha o velikosti stovek nanometrů. Trik je v tom, že se použije externí laser, který má delší vlnovou délku nežli excitační laser. Tento laser se nazývá depleční a osvítí fluorochromy vyšší vlnovou délkou, což způsobí, že emitují světlo o vlnových délkách, které nejsou detektorem zachyceny. Takto se fluorochromy v oblasti mezikruží vyčerpají. Úroveň rozlišení závisí na průměru otvoru v mezikruží. Čím je tato oblast menší, tím vyšší bude výsledné rozlišení a to se pohybuje v desítkách nanometrů, běžně okolo 50 nm v laterární ose a 130 nm v axiální ose. Můžeme tedy sledovat struktury, které dříve nebylo možné rozeznat, a tím se dostáváme dále k poznání nepoznaného. Značnou výhodou těchto systémů je možnost použití superrezolučních technik pro živé organismy, a tím sledovvání procesů a struktur v živých buňkách.