Aktuální číslo:

2018/7

Téma měsíce:

Co kdyby…

Molekuly na obzoru

Cesta za superrozlišením v desítkách nanometrů
 |  7. 4. 2016
 |  Vesmír 95, 222, 2016/4

Nové techniky fluorescenční a konfokální mikroskopie posouvají možnosti v pozorování vnitrobuněčných struktur. Optická mikroskopie byla po dlouhou dobu limitována rozlišením definovaným Abbeho difrakčním limitem.1)

V nedávné době byl tento limit překonán pomocí několika superrezolučních mikroskopických technik, díky nimž se posouváme na úroveň rozlišení několika desítek nanometrů, a tím ještě blíže k molekulární úrovni života.

Velkým posunem v mikroskopii bylo uvedení konfokálního mikroskopu. Konfokální mikroskop používá lasery, které slouží k excitaci fluorescence v rovině ostrosti, a vše, co je nad i pod touto rovinou ostrosti, je odstraněno. Tento tzv. „optický řez“ může být optimalizován pomocí konfokální štěrbiny (pinhole). U takovýchto systémů se používá skener, který laserovým bodem budí excitaci pouze v daném bodě a skládá obraz řezu. Fluorescenční signály jsou zachyceny elektronickými detektory. Výsledný obrázek má díky takovému procesu vyšší rozlišení. Sofware je poté schopný poskládat jednotlivé optické řezy do 3D obrázku. Ten je vhodnější pro rekonstrukci struktur, tkání a dalších biologických preparátů. Rozlišení, které je možné takto dosáhnout, je řádově okolo 200 nm.

Při použití konfokálních mikroskopů stále narážíme na omezení definované difrakčním limitem.1) Některé systémy tento limit obcházejí použitím matematických, korelačních mikroskopických metod. Na světě se však objevila ryze fyzikální metoda, kterou je možné tento limit prolomit. Tato metoda se nazývá STED (Stimulated emission depletion). Za nejenom tento objev byla udělena Nobelova cena Ericu Betzigovi, Stefanu W. Hellovi, Williamu E. Moernerovi za chemii v roce 2014. Tato superrezoluční technika je založená na principu zhášení fluorescence. Základem je použití laserů pro buzení fluorescence podobně jako u konfokálních mikroskopů. I zde se skenuje bodovým skenerem plocha o velikosti stovek nanometrů. Trik je v tom, že se použije externí laser, který má delší vlnovou délku nežli excitační laser. Tento laser se nazývá depleční a osvítí fluorochromy vyšší vlnovou délkou, což způsobí, že emitují světlo o vlnových délkách, které nejsou detektorem zachyceny. Takto se fluorochromy v oblasti mezikruží vyčerpají. Úroveň rozlišení závisí na průměru otvoru v mezikruží. Čím je tato oblast menší, tím vyšší bude výsledné rozlišení a to se pohybuje v desítkách nanometrů, běžně okolo 50 nm v laterární ose a 130 nm v axiální ose. Můžeme tedy sledovat struktury, které dříve nebylo možné rozeznat, a tím se dostáváme dále k poznání nepoznaného. Značnou výhodou těchto systémů je možnost použití superrezolučních technik pro živé organismy, a tím sledovvání procesů a struktur v živých buňkách.

Poznámky

1) Žádný optický systém není naprosto dokonalý. Body proto v mikroskopu nezobrazují jako body, ale jako plošky. Se zmenšující se numerickou aperturou a rostoucí vlnovou délkou se tyto plošky zvětšují. Difrakční limit popisuje vzdálenost dvou bodů, kdy jejich obrazy (plošky) splynou v jednu a není možné je rozlišit. Pro fialové světlo to je 200 nm (polovina jeho vlnové délky).

Ke stažení

OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Mikroskopie
RUBRIKA: Glosy

O autorovi

Martin Kopecký

 

Doporučujeme

Člověk páchne *alkoholem

Člověk páchne *alkoholem audio

Jaroslav Petr  |  5. 8. 2018
Že pach lidského těla „vyrábějí“ bakterie, se ví už relativně dlouho. Některé mechanismy tohoto procesu jsou ale dosud stále tajemstvím. Britští...
Do světa a zase zpět

Do světa a zase zpět

Eva Bobůrková  |  31. 7. 2018
Mladý lékař Karel Kieslich o sobě říká: „Splňuji archetyp českého Honzy“. Studuje totiž na University College v Londýně, chtěl by ve světě...
Zahalená Venuše

Zahalená Venuše uzamčeno

Jan Veselý  |  16. 7. 2018
Snímky pořízené ve viditelném a infračerveném oboru kamerou VIRTIS sondy Venus Express zachycují pozoruhodná oblaka v nejvyšších vrstvách...

Předplatným pomůžete zajistit budoucnost Vesmíru

Tištěná i elektronická
verze časopisu
Digitální archiv
od roku 1994
Speciální nabídka
pro školy a studenty

 

Objednat předplatné