Širokospektrální bílý laser v konfokální mikroskopii

Zásadní a revoluční změnou pro celou biologii a chemii byl objev GFP (Green Fluorescent Protein) v šedesátých a sedmdesátých letech a jeho klonování a vývoj obdobných proteinů v devadesátých letech minulého století. Jeho relativně jednoduché a šetrné zabudování do živého organismu umožňuje pomocí fluorescenčních, resp. konfokálních mikroskopů sledovat konkrétní procesy v organismu. Pánové Osamu Shimomura, Roger Tsien a Martin Chalfie dostali za objev a využití zeleného fluorescenčního proteinu v roce 2008 Nobelovou cenu za chemii.

Po prolomení Abbeho difrakční bariéry konfokálními systémy pro „superrozlišení“ Leica STED a 4pi bylo jednou z posledních výzev, na kterou musí výrobci konfokálních mikroskopů reagovat, obrovské množství požadovaných excitačních a emisních pásem, která jsou charakteristická pro každý jednotlivý nově vyvinutý fluorescenční protein. Konvenčním řešením je vývoj nových excitačních laserů a k nim odpovídajících dichroických filtrů. Mnohé současné konfokální mikroskopy obsahují až 5 různých laserů s až 3 různými excitačními maximy. Karusel s dichroickými filtry obsahuje až 8 pozic a pro další nové spektrální charakteristiky již nestačí.

Ideální, a hlavně mnohem jednodušší řešení je nový konfokální mikroskop Leica TCS SP5X vybavený laserem s bílým světlem (WLL – White Light Laser). Použití bílého laseru se všemi viditelnými vlnovými jednotkami umožňuje nahradit karusel s dichroickými filtry jednotkou nazvanou AOBS (Acusto Optical Beam Splitter). Jde v principu o skleněný krystal, který po přiložení určitého střídavého napětí s akustickou frekvencí dokáže excitační světlo z laseru ohnout do směru optického paprsku mikroskopu, zatímco emisní světlo s delší vlnovou délkou od vzorku nechává bez útlumu procházet. To znamená, že nyní můžeme naprosto plynule elektronicky nejen vybírat libovolné vlnové délky z bílého laseru, ale stejným způsobem plynule měnit jejich intenzitu a každou tuto vlnovou délku dostat do směru optického paprsku mikroskopu.

Leica TCS SP5X znamená konec s horečným vývojem nových laserů a filtrů ke každému nově vyvinutému fluorescenčnímu barvivu, neboť nyní stačí jen posunout kurzor na řídicím monitoru a vše je automaticky nastaveno.

Princip, ovládání a výhody laditelného bílého laseru v konfokální mikroskopii

Zatímco pro vícefotonovou konfokální mikroskopii jsou laditelné laserové zdroje standardem, jednofotonová konfokální mikroskopie laditelný bílý laserový zdroj postrádala. V posledních letech uvedly různé firmy na trh různé bílé laserové zdroje. Jenže tento zdroj s dichroickými filtry postrádá smysl. Vynikajícím řešením, které nabízí firma Leica ve spolupráci s firmou Koheras, je laditelný bílý laser založený na superkontinuálním vlákně spolu s AOBS. Navázáním laserových pulzů o vysoké intenzitě do vlákna z fotonických krystalů (PCF – Photonics Crystal Fibre) je možné na výstupu z tohoto vlákna dosáhnout širokého světelného superkontinua. Vlákno z fotonických krystalů je mikrostrukturní, uvnitř s malými dírkami v různých kombinacích. Nelineárními jevy v tomto vlákně je vstupní monochromatický signál změněn na bílé spektrum. AOBS se postará o navázání libovolné vlnové délky do paprsku mikroskopu. Velký rozdíl oproti standardním laserům je v ovládání bílého laseru. U současných systémů se laditelné prvky (AOTF a AOBS) kalibrují jenom na několik používaných vlnových délek, ale u bílého laseru jsou AOTF a AOBS automaticky plynule laděné během skenování v celém rozsahu vyzařovaného spektra bílého laseru. Velkou výhodou bílého laseru je také to, že ladění excitačních vlnových délek je možné nejen při vypnutém snímání, ale i v samotném průběhu snímání, čímž se otevírají nové možnosti pro spektrální skenování přes různé vlnové délky, tzv. postupný lambda-sken. Doposud byl lambda-sken omezen na proskenování oblastí emisních spekter mezi excitačními vlnovými délkami a počet oblastí byl dán počtem laserů. Nyní je u laditelného bílého laseru možné v rámci jednoho průběžného skenování lambda použít postupně všechny vlnové délky a tomu odpovídající různé části detekčního spektra.

Výhody laditelného bílého laseru:

• uživatel si může zvolit optimální vlnovou délku pro získání ideální absorpce, přičemž není omezen jednotlivými dosud dostupnými lasery, které obvykle nejsou v absorpčním maximu;
• praktické použití nových, dosud nedostupných excitačních vlnových délek v laserové konfokální mikroskopii;
• jeden světelný zdroj nahradí několik opticky propojených laserů pro víceparametrové konfokální fluorescenční zobrazení;
• nastavení celého mikroskopu „šité na míru“ specifickým požadavkům všech experimentů.