Buněčná smrt

Apoptóza, jedna z forem programované buněčné smrti, se u živočichů (obratlovců i bezobratlých) vyskytuje v průběhu ontogenetického vývoje. Do popředí zájmu molekulárních biologů se studium apoptózy dostalo teprve v posledním desetiletí. Nové poznatky ve výzkumu buněčné smrti umožnily pokrok v léčbě nádorů i některých neurodegenerativních onemocnění. Názory na buněčnou smrt se vyvíjejí už téměř 150 let a prošly řadou proměn. Zatímco v minulosti se studiem buněčné smrti téměř nikdo nezabýval, dnes toto téma zajímá nejen biology a biochemiky, ale také lékaře a farmakology.

Apoptóza a nekróza

„Buněčná smrt je degenerativní proces vyvolaný například poraněním. Změny, jež tento proces provázejí, jsou podobné posmrtnému rozkladu probíhajícímu v uhynulých živočiších.“ Přibližně takto formuloval buněčnou smrt patolog R. Virchow v polovině 19. století. Není proto divu, že se o ni badatelé nijak zvlášť nezajímali. Až v polovině 20. století si všimli, že je buněčná smrt součástí normálního vývoje živočišných embryí. Skutečnost, že by „přirozená“ buněčná smrt mohla být aktivní proces řízený samotnou odumírající buňkou, však byla přehlížena ještě dlouho. Teprve v sedmdesátých letech 20. století se začala buněčná smrt zkoumat systematicky, na základě morfologických znaků (zasloužil se o to australský patolog J. F. Kerr, viz např. Ilja Trebichavský: Apoptóza, Vesmír 73, 550, 1994/10). Tento přístup umožnil nejen spolehlivě zjistit, které buňky jsou mrtvé, ale také rozlišit dva základní typy buněčné smrti: apoptózu a nekrózu.

Apoptóza se vyznačuje charakteristickou kondenzací buňky i jádra. Představuje aktivní buněčnou smrt, na které se odumírající buňka podílí aktivací specifických genů. Výskyt apoptózy byl spojován s fyziologickými podmínkami a omezoval se spíše na jednotlivé buňky. Zjistilo se, že apoptotické buňky nezpůsobují zánět v okolní tkáni a jsou sousedními buňkami pohlcovány. Naproti tomu nekróza byla definována jako pasivní buněčná smrt, jež se vyskytuje za nefyziologických podmínek, například po působení toxinů (obr. 1). Charakteristickým morfologickým rysem nekrózy je bobtnání mitochondrií i celých buněk, jež končí rozpadem všech buněčných struktur a organel. Nekróza postihuje skupiny buněk a v okolní tkáni vyvolává zánět. Biochemické studie prokázaly, že charakteristické změny v morfologii jádra jsou u apoptotických buněk spjaty s aktivací endonukleáz, ¹⁾ jež štěpí jadernou DNA na fragmenty o definované velikosti.

V osmdesátých letech 20. století se výzkum zaměřil na studium mechanizmů apoptózy, především na úlohu endonukláz. I když bylo shromážděno velké množství experimentálních dat, dílčí procesy apoptózy na molekulární úrovni se podařilo odhalit až v letech devadesátých. Zásluhou imunologů se zjistilo, že u apoptotických buněk probíhají na povrchu cytoplazmatické membrány změny, které umožňují „žravým buňkám“ – makrofágům – bezpečně rozpoznat odumírající buňky a pohltit je. Za nejpodstatnější lze označit objevy v molekulární biologii. Skupině vědců vedené H. R. Horwitzem (viz Vesmír 82, 133, 2003/3) se podařilo identifikovat geny smrti u háďátka (Caenorhabditis elegans), jejich biochemické funkce však známy nebyly. Stejně tak nebylo zřejmé, nakolik jsou mechanizmy buněčné smrti u háďátka platné pro ostatní živočichy.

Přibližně v téže době studovali badatelé zabývající se zánětlivými reakcemi proteázu ²⁾ odpovědnou za aktivaci cytokinu ³⁾ interleukinu-1β. Všimli si, že tato proteáza a produkt genu smrti ced-3 u háďátka jsou si podobné, a díky tomu pak byla objevena nová rodina savčích cysteinových proteáz, které dostaly název kaspázy. Brzy se podařilo prokázat, že naprosto odlišné podněty indukující buněčnou smrt směřují k společnému projevu, totiž k aktivaci kaspáz odpovědných za částečný proteolytický rozklad buněk, jenž se projevuje apoptózou. Tyto poznatky umožnily „smazat pomyslný rozdíl“ mezi apoptózou během ontogenetického vývoje a apoptózou indukovanou například chemickými činidly.

Apoptóza se obvykle dělí na tři fáze: nastartována je poškozením buňky, stresem nebo změnou v hladině hormonů, pak nastoupí regulační geny, které buď spustí opravné mechanizmy, nebo aktivují kaspázové proteázy, a nakonec je buňka usmrcena, to znamená, že většina důležitých buněčných proteinů je kaspázami nevratně rozštěpena. Nevratně zničena (rozštěpena endonuklázami) je rovněž jaderná DNA.

Nekróza sice nebyla při výzkumu programované buněčné smrti hlavním předmětem zájmu, nicméně bylo prokázáno, že se na nekrotickém rozkladu buněk podílejí zejména kalpainy (skupina cysteinových proteáz aktivovaných ionty vápníku) i jiné proteázy.

Koncem devadesátých let minulého století se zjistilo, že si některé výsledky navzájem odporují. Ukázalo se totiž, že existují druhy programované buněčné smrti, které mají morfologii spíše nekrotickou než apoptotickou, ačkoliv využívají aktivaci „apoptotických“ biochemických drah. Dále se zjistilo, že buněčná smrt není stoprocentně spojena s určitým typem kontrolního nebo prováděcího mechanizmu, apoptotická morfologie může být také na aktivaci kaspázových proteáz nezávislá. Potlačením aktivity kaspáz nelze buněčné smrti zabránit, ale lze ji pozměnit z apoptotické na nekrotickou. Z uvedených faktů vyplynulo, že apoptóza a nekróza představují spíše alternativy základního programu buněčné smrti než protiklady. Krom toho bylo již zřejmé, že kaspázové proteázy nejsou v procesu apoptózy jedinými proteolytickými činiteli.

Tři možnosti programované buněčné smrti

Obecnější třídění programované buněčné smrti zavedl švýcarský embryolog J. Clark. Ačkoliv bylo formulováno už koncem osmdesátých let 20. století, širšího ohlasu dosáhlo teprve v posledních letech. Clark definoval tři základní morfologické typy programované buněčné smrti: apoptotickou, autofagickou ⁴⁾ a nelyzozomální. Jeho rozdělení odráží také různé mechanizmy destrukce buněk podle účasti lyzozomů. Při heterofagii (apoptóze) se na destrukci buňky nepodílejí vlastní lyzozomy, její „zbytky“ pohltí lyzozomy okolních buněk (obr. 2). Pro autofagii je naopak charakteristické, že hlavní podíl na degradaci mají vlastní lyzozomy (obr. 3). Při nelyzozomální degradaci probíhá proteolýza přímo v cytoplazmě hynoucích buněk.

• Apoptóza je u živočichů nedílnou součástí embryogeneze, ontogenetického vývoje a diferenciace buněk. Slouží k udržování homeostáze ve tkáních, podílí se na obnově buněk, hraje nezastupitelnou roli při vývoji imunitního systému. Řada fyzikálních a chemických podnětů vyvolává programovanou buněčnou smrt, která se morfologicky i biochemicky projevuje jako apoptóza. Klíčovou roli v procesu apoptózy u živočichů hrají kaspázy – cysteinové proteázy, které štěpí cílovou sekvenci proteinu za kyselinou asparagovou. ⁵⁾ Jsou syntetizovány jako neaktivní proenzymy – aktivují se proteolytickým štěpením na velkou a malou podjednotku (aktivní enzym se pak skládá ze dvou podjednotek větších a dvou menších). Aktivace kaspáz je do značné míry prostudována u savčích buněk, kde rozeznáváme tři mechanizmy: s přímou účastí mitochondrií, prostřednictvím extracelulárních receptorů a granzymem B. ⁶⁾ Proces apoptózy je regulován kaskádou genů a řada regulačních drah je již prostudována do detailů.
• Autofagie je na molekulární úrovni prostudována poměrně málo. Nejlépe je prozkoumána u kvasinek, kde už byly identifikovány některé geny, které se na tomto procesu podílejí. Je zřejmé, že autofagie je fylogeneticky zakonzervovaný proces, neboť neexistuje zásadní rozdíl mezi kvasinkami a živočišnými nebo rostlinnými buňkami. Při autofagii jsou nitrobuněčné struktury pohlcovány a rozkládány lyzozomálními enzymy. Za fyziologických podmínek udržuje tento proces dostatečné zásoby intracelulárních aminokyselin jednak pro syntézu proteinů, jednak pro glukoneogenezi. ⁷⁾ Autofagie se rovněž podílí na obnově organel. Patologické podmínky, například nedostatek kyslíku, toxický šok nebo hladovění, také iniciují autofagii, jež vede k úplné destrukci buňky. Hlavním proteolytickým činitelem autofagie u živočišných buněk jsou katepsiny – vesměs cysteinové proteázy, jež se hromadí v lyzozomech.
• Nelyzozomální degradace se vyskytuje ve srovnání s apoptózou a autofagií poměrně zřídka a je také nejméně prostudována. Navrženy byly tři teorie vysvětlující aktivaci cytoplazmatických proteáz, jež jsou odpovědné za degradaci buňky. První teorie předpokládá, že jsou proteázy uvolněny z lyzozomů, podle druhé pocházejí z endoplazmatického retikula (buněčné organely podílející se na tvorbě řady látek) a podle třetí jsou v neaktivním stavu přítomny v cytoplazmě a aktivuje je zatím neznámý mechanizmus.

Ani Clarkovo třídění programované buněčné smrti podle účasti lyzozomů však nelze akceptovat všeobecně. Zjistilo se totiž, že se katepsiny uvolněné z lyzozomů mohou podílet na aktivaci kaspázových proteáz.

Buněčné organely jako senzory buněčné smrti

Nejnovější přístup ke klasifikaci programované buněčné smrti odhlíží od morfologických znaků a klade důraz na mechanizmy spouštějící tento proces. Ukazuje se, že je možné identifikovat jednotlivé buněčné organely, které přijímají prvotní signály buněčné smrti a podle intenzity signálu spouštějí buď „obrannou“ reakci, jež směřuje k rovnováž­nému stavu (homeostázi) buňky, nebo programovanou buněčnou smrt, při extrémním podnětu eventuálně i nekrózu.

Mezi nejdříve identifikované buněčné struktury vyvolávající apoptózu patří cytoplazmatická membrána a její „receptory smrti“. ⁸⁾ Organelově specifickou odpověd, která může vyústit v programovanou buněčnou smrt, vyvolává rovněž poškození jádra, respektive DNA. K mediátorům předávajícím signál z jádra dále patří některé proteinkinázy, ⁹⁾ protein p53 ¹⁰⁾ a reaktivní kyslíkové radikály. Na zahájení apoptózy se podílí také endoplazmatické retikulum, které uvolňuje vázané ionty vápníku a ovlivňuje „skládání“ proteinů. V úvahu přichází rovněž Golgiho komplex, u kterého není jednoznačně prokázáno, zda funguje také jako senzor buněčného stresu. Existuje však řada důkazů o přesunu některých proteinů, jež se účastní regulace apoptózy, z Golgiho komplexu a o jejich následné aktivaci při buněčném stresu. Lyzozomy jsou mimořádně citlivé k působení reaktivních kyslíkových radikálů nebo některých toxických látek (antibiotik), jež iniciují změnu propustnosti jejich membrány. Uvolněné lyzozomální proteázy pak mohou aktivovat apoptotickou buněčnou smrt. Detaily tohoto procesu však nejsou zcela prostudovány. Dominantní postavení při spouštění apoptózy a programované buněčné smrti vůbec má mitochondrie. Tato organela je nejen sběračem prvotních stimulů apoptózy, ale také přijímá druhotné signály z ostatních organel a buněčných struktur. Do mitochondrií směřují signální dráhy, které v konečném důsledku ovlivňují propustnost obou membrán. Vnější membrána začne propouštět proteiny a vnitřní ionty, což vede k zhroucení transmembránového potenciálu. ¹¹⁾ Ačkoliv se stále diskutuje o tom, jestli je pro spuštění apoptózy důležitější porušení vnitřní či vnější membrány, je prokázáno, že uvolněné proteiny z mezimembránového prostoru mitochondrií přímo aktivují enzymy, jež se podílejí na destrukci buňky, zejména kaspázy a také endonukleázy. Mezi nejlépe prostudované mitochondriální aktivátory kaspáz patří cytochrom c. ¹²⁾ Jestliže má buňka dostatek energie, tvoří uvolněný cytochrom c s dalšími cytoplazmatickými bílkovinami složitý enzymový komplex, jenž aktivuje kaspázové proteázy.

Programovaná smrt u rostlin

Přibližně před 340 lety pozoroval R. Hook pod mikroskopem první eukaryotické buňky. Shodou okolností to byly jen buněčné stěny buněk korku, které při diferenciaci prošly programovanou buněčnou smrtí. Rostlinní badatelé se ale studiem programované buněčné smrti dlouho vůbec nezabýva­li, přestože se již záhy vědělo, že je programovaná buněčná smrt u rostlin nutná pro tvorbu cévních svazků. Tomuto tématu se začali věnovat až v sedmdesátých letech 20. století, kdy se hojně studovalo programované rozložení embryonálních buněk jejich vlastními enzymy neboli autolýza (viz práce R. Nagla a V. Villierse, kteří na základě morfologických a biochemických studií prokázali, že programovaná autolýza odpovídá do značné míry autofagii u živočišných buněk). Intenzivně se mechanizmy programované buněčné smrti u rostlin zkoumají teprve v posledním desetiletí. Z hlediska morfologických změn lze u rostlin definovat nejméně dva typy programované buněčné smrti: apoptózu a autofagii (obr. 4), i když někteří autoři tuto klasifikaci odmítají a používají pouze termín programovaná buněčná smrt. Zmíněné typy programované buněčné smrti totiž u rostlin nemají vždy všechny morfologické i biochemické znaky charakteristické pro odpovídající typ v živočišných buňkách (někdy se vyskytují znaky pro apoptózu i autofagii zároveň).

• Apoptóza je u rostlin indukována obdobnými fyziologickými nebo patologickými podněty jako u živočichů. Její výskyt byl popsán při působení stresu (například chladového šoku, vysoké teploty, těžkých kovů, chemických látek, vysokých dávek rostlinných hormonů apod.). Kromě toho byla apoptóza také popsána v souvislosti se somatickou embryogenezí u smrku. ¹³⁾ Jako samostatný typ buněčné smrti, jenž morfologicky a biochemicky rovněž odpovídá apoptóze, je nutné uvést hypersenzitivní reakci, což je komplexní obranná reakce rostliny proti patogenům. Provázena je značnou produkcí kyslíkových radikálů a aktivací řady „obranných genů“. Hypersenzitivní reakce se projevuje jako rychlá buněčná smrt v bezprostředním okolí infekce, což účinně brání šíření patogenu. Některé typy hypersenzitivní reakce se však podobají spíše nekróze u živočišných buněk. Experimentálně lze tuto reakci vyvolat bakteriálními toxiny nebo kyselinou salicylovou.

  Je zřejmé, že se mitochondrie podílejí na regulaci apoptózy také u rostlin, i když detailní mechanizmy zatím nejsou známy. Víme jen, že indukci apoptózy u rostlinných buněk předchází uvolnění cytochromu c z mitochondrií. Jak (a zda vůbec) aktivuje cytochrom c uvolněný do cytoplazmy rostlinné proteázy, to zatím nevíme. Bylo již prokázáno, že také při apoptóze u rostlin jsou aktivovány specifické proteázy, které jsou odpovědné za smrt živého obsahu buňky. Dosud však není jasné, které proteázy hrají v tomto procesu hlavní úlohu. Spekuluje se nejméně o třech rozdílných typech: o cysteinových proteázách bez vyhraněného působení, o cysteinových proteázách odpovídajících biochemicky (nikoli geneticky) savčím kaspázovým proteázám a o serinových proteázách. Výrazným rozdílem mezi živočišnou a rostlinnou apoptózou je fakt, že u rostlinných buněk nejsou mrtvé buňky okolními buňkami pohlcovány, tj. neexistuje zde jev obdobný fagocytóze.

• Autofagie se u rostlin morfologicky i biochemicky podobá autofagii živočišné. Také zde je část cytoplazmy nebo organela, která má být pohlcena, „obalena“ dvojitou membránou. Vzniklý útvar potom splyne s vakuolou, ¹⁴⁾ kde je hydrolyticky rozložen. Autofagie byla u rostlin popsána v souvislosti s hladověním nebo stárnutím. Nejnovější výzkumy ukázaly, že při zárodečném vývoji buněk smrku se autofagické a apoptotické morfologické znaky překrývají. Jako hlavní činitel v autofagii rostlin bývají nejčastěji uváděny cysteinové proteázy.

Co považuji za nejzajímavější?

Výzkum buněčné smrti přinesl řadu významných objevů, jež svými důsledky překračují rámec biologie. Změnily náš pohled na úlohu mitochondrií. Ty byly do poloviny devadesátých let minulého století považovány za organely, bez nichž by byl život možný jen stěží, neboť kryjí svou produkcí adenozintrifosfátu většinu energetických potřeb buňky. Od poloviny devadesátých let ale také víme, že mitochondrie aktivně rozhodují o smrti buňky a mají při tomto rozhodování „hlavní slovo“.

Dále se jasně ukázalo, že v říši mnohobuněčných organizmů je smrt pro život naprosto nezbytná, a to nejen ve filozofické rovině.