V hi-tech přístrojích dnešních biologických laboratoří by Antonie van Leeuwenhoek sotva poznal „potomky” mikroskopu, jímž pozoroval svá animalcula. Zdokonalení mikroskopické optiky, optimalizace osvětlení vzorku (zejména využití laserů) a způsobu záznamu spolu s počítačovým zpracováním obrazu dramaticky rozšířily naše znalosti o fungování organismů na úrovni jednotlivých buněk a molekul.

Nabízíme vám obrazově rozšířenou verzi článku, který vyšel ve Vesmíru 2015/06. Ve stejném vydání najdete k tématu mikroskopie také článek Josefa Lhotského Darwin mikroskopik a příspěvek Jana Černého Superrezoluční mikroskopie v biologii (oba on-line přístupné pouze předplatitelům). Z Vesmíru 2015/03 odemykáme článek Zdeňka Rouse Cesta optické mikroskopie k superrozlišení.

Zlomovým bodem při vývoji mikroskopických technik bylo zejména odhalení fluorescence, tedy schopnosti některých látek (fluoroforů) vyzařovat absorbované světlo určité vlnové délky v podobě sekundárního záření o vyšší vlnové délce a nižší energii. Výrazně se tím zvyšuje kontrast sledovaného objektu. Pomocí fluoroforů lze přesně, přímo či nepřímo, označit specifické buněčné struktury (jádro, mitochondrie, endoplasmatické retikulum atd.) nebo biologické makromolekuly, jako jsou proteiny či nukleové kyseliny.

Fluorofory jsou jednak malé molekuly (typicky organické sloučeniny s aromatickým jádrem), je mezi nimi zastoupena i řada přírodních pigmentů (např. chlorofyly rostlin), jednak celé proteiny, např. zelený fluorescenční protein (GFP) a jeho mutační varianty s odlišnými spektrálními vlastnostmi. Takovýmto proteinem lze na genetické úrovni označit i konkrétní protein v buňce a sledovat jeho lokalizaci.

Stereomikroskopy

Spojením dvou samostatných optických soustav (dvou objektivů a dvou okulárů) vznikl stereomikroskop (preparační lupa), který umožňuje získat ostrý trojrozměrný obraz objektu (povětšinou větších rozměrů). Slouží jak k preparačním účelům, tak k pozorování makroskopických detailů. Digitální snímání obrazu poskytuje možnost skládat série odlišně zaostřených snímků, a připravit tak velmi instruktivní ilustrace s velkou hloubkou ostrosti, a to i u objektů s extrémním kontrastem. Stereomikroskopy využívají především systematičtí biologové pro potřeby taxonomie a morfologie, ale slouží například i genetikům či buněčným a molekulárním biologům při lokalizaci produktů přepisu a překladu genetické informace na úrovni celého organismu či tkání. Běžně jsou využívány i fluorescenční varianty stereomikroskopů.

Hlava larvy mrchožrouta.

Hlava larvy mrchožrouta Necrodes littoralis ve stereomikroskopu v kombinovaném dopadajícím a procházejícím osvětlení. Měkké tkáně byly rozpuštěny v horkém 5% roztoku KOH a další části byly manuálně odstraněny, aby byla lépe pozorovatelná ta část endoskeletu, která byla objektem studia. Modré zbarvení membranozních částí je způsobeno mírným kontrastováním chlorazolovou černí. Kompozitní fotografie složená ze série deseti různě zaostřených snímků. (Stereomikroskop Olympus SZH10, autor RNDr. Petr Švácha, CSc., Entomologický ústav, Biologické centrum AV ČR, v.v.i..)

Novotvary vzniklé na těle octomilky přerůstáním somatických mozaikových klonů .

Fluorescenční značení: Novotvar na bázi křídla octomilky, vzniklý přerůstáním somatických mozaikových klonů značených pomocí proteinu GFP. Tyto novotvary vznikají ztrátou obou alel nádorového supresorového genu warts (u lidí se homologický gen nazývá LATS1 a ztráta jeho exprese byla zjištěna u značného množství nádorů). (Stereomikroskop Zeiss SteREO Discovery V.8. Autor Dr. Roman Sidorov, Ph.D., Entomologický ústav, Biologické centrum AV ČR, v.v.i..)

 

Světelné a fluorescenční mikroskopy

Fluorescencí mikroskopy jsou světelné mikroskopy opatřené sadami světelných filtrů a zdrojem osvětlení, který kromě viditelného světla vysílá i UV záření (rtuťová či xenonová výbojka). Sady filtrů obsahují excitační filtr, který oddělí část světelného spektra nutnou k vyvolání fluorescence daného fluoroforu, a emisní filtr, který selektivně propouští pouze vzorkem vyzářenou fluorescenci dále k detektoru.

Klasické světelné a fluorescenční mikroskopy mají obdobné využití jako světelné či fluorescenční stereomikroskopy, ale pozorování probíhají na úrovni organismu či tkáně malých rozměrů nebo v buňce. Větší organismy či objemnější tkáně je nutné nakrájet. Na řezech lze sledovat jednak strukturu tkáně (což mnohdy vyžaduje histologické barvení, popř. označení buněčných struktur fluorescenční značkou), jednak detailní lokalizaci proteinů a nukleových kyselin pomocí specifických protilátek a sond.

Směs planktonních kokálních zelených řas a rozsivek.

Směs planktonních kokálních zelených řas a rozsivek. Tyto řasy představují typické zástupce rybničního fytoplankonu. (Fluorescenční invertovaný mikroskop Olympus IX71, autor: RNDr. Petr Znachor, Ph.D., Hydrobiologický ústav, Biologické centrum AV ČR, České Budějovice)

Sladkovodní mechovka bochnatka americká.

Sladkovodní mechovka bochnatka americká (Pectinatella magnifica), invazní živočich šířící se i v ČR. Na snímku statoblast – chráněný shluk buněk sloužící k nepohlavnímu rozmnožování. (Fluorescenční přímý mikroskop Zeiss Axioplan 2, použitá technika: černé pole + horní boční nasvícení, autorka: doc.Věra Kuttelvašerová Stuchelová, Ph.D., katedra biologických disciplín, Zemědělská fakulta Jihočeské univerzity, České Budějovice)

Lokalizace mRNA genu period v mozku bource morušového.

Lokalizace mRNA genu period v mozku bource morušového. Jeho pomocí identifikujeme neurony obsahující centrální oscilátor biologických hodin. Protilátka proti digoxigeninu navázaném na specifických nukleotidech sondy je značena enzymem alkalickou fosfatázou, která po dodání substrátu tvoří modrý produkt. (Fluorescenční přímý mikroskop Olympus BX50F4, autorka Hana Sehadová.)

Detailní záznam imunodetekce pigment dispersního hormonu (PDH) v neuronech optického laloku saranče stěhovavé.

Detailní záznam imunodetekce pigment dispersního hormonu (PDH) v neuronech optického laloku saranče stěhovavé (Locusta migratoria). Hormon se nachází v cytoplazmě a nervových drahách. Sekundární protilátka je značena enzymem křenovou peroxidázou, která po dodání substrátu tvoří hnědý produkt. Měřítko: 10 µm. (Fluorescenční přímý mikroskop Zeiss Axioplan 2, autorka: doc. PaedDr. Radka Závodská, Ph.D., Entomologický ústav, Biologické centrum AV ČR, České Budějovice a Pedagogická fakulta JU České Budějovice)

Odhalit lze i přítomnost signálu v nervových drahách a studiem paralelních řezů provést jejich přibližnou rekonstrukci. K přesné specifikaci polohy pozitivního signálu ve tkáni mnohdy napomůže srovnání podélných a příčných řezů. Při souběžné detekci více proteinů lze stanovit jejich vzájemnou polohu, např. blízkost značených nervových drah naznačuje možnost synaptického kontaktu neuronů. Tyto informace významně přispívají ke studiu signálních drah a molekulárních mechanismů řídících rozličné fyziologické procesy.

Imunodetekce kasein kinazy I (CKI) ve složeném oku bource morušového.

Imunodetekce kasein kinazy I (CKI) ve složeném oku bource morušového. (A) Podélný řez celým okem; šipka ukazuje pozitivní reakci v omatidiích sítnice složeného oka. (B) Detail příčného řezu sítnicí ukazuje, že všechny fotoreceptorové buňky ve všech omatidiích jsou CKI-pozitivní. Sekundární protilátka je značena enzymem křenovou peroxidázou, která po dodání substrátu tvoří hnědý produkt. Měřítko: 100 µm. (Fluorescenční přímý mikroskop Olympus BX50F4, autorka Hana Sehadová.)

Testování schopností genů blokovat buněčnou smrt.

Testování schopností genů blokovat buněčnou smrt. Na hmyzí epiteliální buňky ve tkáňové kultuře se působí jedovatou látkou a zároveň se do buněk vnáší genetické nástroje (expresní plazmidy, dsRNA), které aktivují nebo naopak umlčují vybrané geny. Vložíme-li současně s nimi fluorescenční protein GFP, jenž může sloužit jako indikátor úspěšného přenosu nástrojů do buněk, lze podle jejich morfologie usoudit, zda nástroj s příslušným genem je schopen zvýšit jejich životaschopnost (živé buňky mají podlouhlý tvar s výběžky, umírající buňky jsou kulaté bez výběžků. (A) Celá populace buněk zaznamenaná v procházejícím světle. (B) Buňky obsahující GFP svítí zeleně. (C) Na obrázku vzniklém spojením obrázku A a B lze sledovat tvar čili životaschopnost svítících buněk. (Fluorescenční invertovaný mikroskop Olympus IX73P2F, autorka: RNDr. Anna Žaloudíková, Entomologický ústav, Biologické centrum AV ČR, České Budějovice)

 

 Konfokální mikroskopy

V biologickém výzkumu se ujaly především laserové skenovací konfokální mikroskopy, tedy fluorescenční mikroskopy využívající systému bodového osvětlení vzorku a detekce signálu fluorescence pouze z jednoho bodu v rovině zaostření. Umožňuje to předsazení konfokální clony před detektor. Celkový obraz vzorku se pak získá postupným snímáním fluorescence všech bodů v rovině ostrosti. 1 Toto nastavení značně zvětšuje rozlišení konfokálních mikroskopů oproti standardním fluorescenčním mikroskopům.

Bodové osvětlení zajišťují speciální zdroje světla, jako jsou plynové či diodové lasery. Moderní přístroje jsou vybaveny systémem s třemi až pěti lasery pro excitaci různých fluoroforů. Pro přesnou detekci emise fluoroforu se využívají laditelné spektrální detekční systémy. Ty umožňují variabilně měnit rozsah detekované vlnové délky emise fluorescence; to je výhoda oproti fixní vlnové délce u dříve používaných optických filtrů. V kombinaci s fotonásobiči, které jsou vysoce citlivé v blízkém ultrafialovém, viditelném i blízkém infračerveném světle, jsou tyto mikroskopy schopné detekovat fluorescenci v rozsahu 400 až 800 nanometrů. Konfokální mikroskopy tudíž neinvazivním a nedestruktivním způsobem provádějí optické řezy živými či fixovanými tkáněmi do hloubky až 100 mikrometrů. Navíc při plynulém proostřování objektu v ose z můžeme získat sérii optických řezů v různých rovinách ostrosti, jejichž skládáním lze rekonstruovat i 3D projekci větších objektů. 2

K základním přednostem konfokální mikroskopie tudíž patří odfiltrování rušivého pozadí z mimoohniskových rovin obrazu, vyšší rozlišovací schopnost a možnost počítačové tomografie (zobrazování rovinných řezů). Rekonstrukce 3D obrazu umožňuje např. stanovit přesnou pozici a počet značených buněk ve tkáni nebo studovat detailní projekci nervových vláken. Možnost optických průřezů studovaným objektem odhaluje informace nedosažitelné za použití klasického fluorescenčního mikroskopu.

Neurony tzv. Johnstonova orgánu v druhém článku tykadel octomilky.

Neurony tzv. Johnstonova orgánu v druhém článku tykadel octomilky. Jedná se o sluchový receptor, který vnímá kmitání molekul přenášených vzduchem. Neurony byly zviditelněny pomocí zeleného (cytoplazma) a červeného (jádra) fluorescenčního proteinu. 3D rekonstrukce obrazu vznikla složením série optických řezů pořízených konfokálním mikroskopem. Měřítko: 10 µm. (Laserový skenovací konfokální mikroskop Olympus FluoView FV1000, autorka Hana Sehadová.)

Rýhující se myší embryo.

Rýhující se myší embryo. (A) čtyřbuněčné stadium (2 dny po oplodnění), (B) šestnáctibuněčné stadium (3 dny po oplodnění). 3D obraz vznikl složením série optických řezů pořízených konfokálním mikroskopem. Barveno rhodamin phalloidinem (značí aktin – na obrázku bíle) a DAPI (značí DNA buněčných jader). Jádro každé z buněk čtyřbuněčného stadia a jádra jejich dceřinných buněk v šestnáctibuněčném stadiu jsou uměle různobarevně označena. Ve čtyřbuněčném stadiu je ještě patrná malá pólová buňka (žlutě). Měřítko: 10 µm. (Laserový skenovací konfokální mikroskop Olympus FV10i, autoři M.Sc. Aleksandar Mihajlovic a Alexander W. Bruce, Ph.D., PřF Jihočeské univerzity.)

Na subcelulární úrovni slouží konfokální mikroskopie například k výzkumu mitotického aparátu či nukleární architektury, a to především ke studiu distribuce chromosomů jádra v interfázi. Pomocí fluorescenčně značených nukleárních sond a protilátek lze studovat jak pozici jednotlivých chromosomálních segmentů uvnitř jádra, tak i interakce vzdálených genových regulačních sekvencí. Funkce časosběrných snímků zaznamenává dynamické procesy v živých buňkách a tkáních, jako je např. buněčná mitóza či chování prvoků. Pro studium fluoroforů, u kterých dochází k rychlému fotovybělení, či pro dokumentaci velmi rychlých buněčných dějů, např. studium vápníkových kanálů, se využívají systémy skenující vzorek paralelně více laserovými paprsky (Multiple-beam), čímž je výrazně zkrácena doba skenování.

Průřez rýhujícím se myším embryem.

Průřez rýhujícím se myším embryem na přechodu z osmibuněčného na šestnáctibuněčné stadium. Tubulin (zeleně) je detekován pomocí protilátky proti alfa tubulinu, buňěčná jádra jsou barvena DAPI (červeně). Jedná se o obraz jedné optické roviny pořízené konfokálním mikroskopem. (Laserový skenovací konfokální mikroskop Olympus FV10i, autoři M.Sc. Aleksandar Mihajlovic a Alexander W. Bruce, Ph.D., PřF Jihočeské univerzity.)

Mitotické dělení buněk během časného embryonálního vývoje octomilky.  Celkový pohled na embryo. Buněčná dělení probíhají lavinovitě směrem od vegetativního k apikálnímu póĺu embrya. Červeným fluorescenčním proteinem (RFP) je značen histon 2A, který je součástí bílkovinných komplexů, okolo nichž se obtáčí DNA eukaryot. Zeleným fluorescenčním proteinem (GFP) je značen protein Jupiter vážící se na mikrotubuly. (Konfokální mikroskop Olympus FlouroView FV1000. Autor videa Dr. Peter Vilmos Ph.D., Biological Research Center, Szeged, Hungary.)

Mitotické dělení buněk během časného embryonálního vývoje octomilky – stejné jako předchozí video, tentokrát je však zachycen detailní záznam mitózy.

Lokalizace konců chromosomů, tzv. telomer.

Lokalizace konců chromosomů, tzv. telomer, v polytenním jádru buňky slinných žláz octomilky. Chromosomy jsou barvené pomocí DAPI (modře). Telomery jsou vizualizovány pomocí fluorescencně značené sondy (červené úseky). (Laserový skenovací konfokální mikroskop Olympus FluoView™ FV1000, autorka: RNDr. Radmila Frydrychová, Ph.D., Entomologický ústav, Biologické centrum AV ČR, České Budějovice)

 

Mechanismus přeměny pohyblivého bičíkatého stádia jednobuněčného hmyzího parazita Paratrypanosoma confusum na přisedlé bezbičíkaté stádium. Po přisednutí k podkladu buňka neustále mění svoji polohu. Současně v buňce nastávají morfologické změny a dochází ke zkracování bičíku. Zajímavé je, že i v přisedlém stádiu se buňka dělí, přičemž nově vznikající buňky dceřinné jsou primárně bezbičíkaté. (Konfokální mikroskop Olympus FlouroView FV1000. Autoři videa Mgr. Eva Dobaková a Mgr. Tomáš Skalický, Parazitologický ústav, Biologické centrum AV ČR, České Budějovice.)

 

Pokročilé techniky fluorescenční mikroskopie

Multifotonová mikroskopie je založena na principech nelineární optiky. Rovina zaostření je osvícena velmi intenzivním pulzním laserem, který vyzařuje fotony o nízké energii (typicky infračervený laser). Jejich energie nestačí na to, aby byly absorbovány fluoroforem. K absorpci (a následné emisi fluorescence) dochází jen v případě současné absorpce dvou fotonů o nízké energii v jeden okamžik, což se děje při vysoké intenzitě v místě zaostření. Tato metoda je tedy vhodná pro rozptylující vzorky (infračervené fotony nejsou rozptylovány a jsou absorbovány jen v místě zaostření) a pro studium fluoroforů, u kterých dochází k rychlému fotovybělení.

TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) mikroskopy využívají fyzikálního jevu evanescentní vlny, která vzniká při totálním odrazu světla (např. laserového paprsku) na rozhraní dvou prostředí (rozhraní sklo – voda se vzorkem). Při osvětlení vzorku pod úhlem způsobujícím totální odraz do vzorku proniká pouze evanescetní vlna, a to jen v tenké vrstvičce blízko rozhraní (přibližně 200 nanometrů), kde je absorbována fluorofory. Díky tomu je snímán pouze signál z této vrstvičky, což značně zvyšuje rozlišení v ose z. HILO (Highly Inclined and Laminated Optical Sheet) mikroskopy mohou TIRF efekt posunout do vzdálenějších vrstev vzorku.

Mikroskopy vysokého rozlišení (superrezoluce) posunuly rozlišovací schopnosti fluorescenční mikroskopie z oblasti mikrometrů téměř desetinásobně až na hranici 20 až 50 nanometrů. Více o nich v článku Jana Černého Superrezoluční mikroskopie v biologii (Vesmír 2015/06, dostupné pouze předplatitelům).

Kouzla s fluorescencí

FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching, v překladu „návrat fluorescence po fotovybělení“) je základní fluorescenční metoda pro studium mobility proteinů. Mobilita je dána jak rychlostí difúze proteinů v buňce či v buněčné organele, tak vzájemnou interakci proteinů mezi sebou nebo s okolím (např. s membránou). Mobilitu lze měřit u fluorescenčně značených proteinů (například za pomoci GFP), ale i u autofluorescenčních fotosyntetických proteinů. 3 Základem metody FRAP je série časosběrných mikroskopických snímků. Na počátku série je fluorescence proteinů v buňce něměnná. Následně se v určité části buňky či organely sníží efektem tzv. fotovybělení: vlivem krátkodobého zvýšení intenzity laseru dochází k nevratnému poklesu fluorescence proteinů ve vybrané oblasti. Vlivem difúze proteinů z oblastí mimo fotovybělení se fluorescence ve fotovybělené oblasti postupně vrací a kinetika tohoto návratu odráží mobilitu studovaného proteinu.

Časosběrná série snímků fluorescence fykobilizomů ruduchy Porphyridium cruentum získaná metodou FRAP.

Časosběrná série snímků fluorescence fykobilizomů ruduchy Porphyridium cruentum získaná metodou FRAP. (Fykobilizomy jsou pigmentované proteinové komplexy sloužící k zachytávání světla.) Vlivem krátkodobého zvýšení intenzity laseru (červená obdelníková oblast v čase t = 8 s) poklesne fluorescence fotovybělených proteinů ve vybrané oblasti. V průběhu času dochází k postupnému návratu fluorescence v oblasti fotovybělení vlivem difúze proteinů z okolí. Návrat fluorescence odráží mobilitu fykobilizómů a jejich mobilní frakci. Měřítko: 3 µm. (Laserový skenovací konfokální mikroskop Olympus FluoView™ FV1000. Autor Radek Kaňa.)

Fluorescenční metoda FRAP („návrat fluorescence po fotovybělení“) – viz předchozí odstavec a popiska obrázku.

Metoda FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) zobrazuje vzorek na základě rozdílné doby života flurescence fluoroforů. Jde o průměrný čas (řadově miliontiny až miliardtiny sekundy), po který molekula zůstává v excitovaném stavu před návratem do stavu základního. Během zobrazení se měří doba života fluorescence v každém bodě (pixelu; jejich počet závisí na rozlišení obrazu), což umožňuje sledovat kontrast mezi látkami značenými různými fluorofory, a to i v případě, že mají stejná emisní maxima, ale liší se rozdílnou dobou života své fluorescence.

Energie fluoroforu v excitovaném stavu nemusí být jen vyzářena ve formě fluorescence, může být také přenesena z excitovaného fluoroforu (donor) na jiný fluorofor (akceptor). Tento proces je základem techniky FRET (Förster Resonance Energy Transfer) a dochází k němu v případě, kdy absorpční spektrum akceptoru se překrývá s emisním spektrem donoru a zároveň dárce i příjemce se nacházejí ve velmi těsné blízkosti (řádově nanometry). To umožňuje sledovat procesy hluboko pod rozlišovací schopností standardních mikroskopických metod. Z intenzity FRET získáme informaci o míře interakce molekul, o vzájemné poloze fluoroforů v buňce, popř. o jejich konformačních změnách. Metoda se uplatňuje při studiu interakcí protein-protein, protein-DNA, při studiu konformačních změn proteinů, polynukleotidů, DNA a při analýze vazebných sekvencí.

Novinkou posledního desetiletí je bioluminiscenční mikroskopie. Na rozdíl od fluorescenčních metod nevyžaduje excitaci světlem a k emisi fotonů dochází vlivem chemické reakce. Např. luciferin nebo coelenteracin podstupují za přítomnosti enzymu luciferázy či aequorinu oxidaci, jejímž produktem je molekula v excitovaném stavu. Ta se následně deexcituje emisí fotonu a emitované světlo je zaznamenáno.

Variantou FRET pro bioluminiscenci je BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), kde jsou molekuly donoru značeny luciferiny. Jejich luminiscence je spouštěna chemickou reakcí katalyzovanou luciferázou a tudíž k excitaci akceptoru není nutno vzorek osvětlovat. Tak se zabrání šumu způsobenému přímou excitací či vybělováním příjemce.

Elektronové mikroskopy

Elektronové mikroskopy se používají především tam, kde je potřeba velké rozlišení. Je to dáno výrazně kratší vlnovou délkou urychlených elektronů, které se v elektronových mikroskopech používají k ozařování vzorku.

Rastrovací (řádkovací) elektronový mikroskop (SEM) je populárním nástrojem pro zobrazování hlavně povrchových struktur a často se díky své mimořádné hloubce ostrosti a rozsahu zvětšení využívá i tam, kde by stačilo rozlišení a zvětšení poskytované světelnými mikroskopy. Snímky z něj mají až prostorový charakter. Pracuje na principu skenování malé oblasti na povrchu vzorku pomocí přesně zaostřeného svazku urychlených elektronů a současné detekce signálů, které vznikají v důsledku interakce mezi primárními elektrony a atomy vzorku. Současné přístroje mohou dosáhnout rozlišovací schopnosti až 1 nm.

Povrch zadečku samice klíštěte obecného .

Povrch zadečku samice klíštěte obecného připomíná harmoniku. Díky této varhánkovité struktuře je dospělá samička schopná zvětšit objem svého těla při sátí až 300krát. Snímek byl počítačově kolorován. (Rastrovací elektronový mikroskop JEOL7401F, autoři Ing.Jana Nebesářová, CSc. a Jiří Vaněček, Parazitologický ústav, Biologické centrum AV ČR, v.v.i.)

Nevýhodou je, že vnitřní prostor SEM je vyčerpán na určitou hodnotu vakua, takže biologické preparáty je třeba zbavit vody. Pokud by to vedlo k poškození tvaru či povrchové morfologie, je možné použít environmentální SEM, kde preparátová komora není zcela vyčerpána. Další možností je přeměnit vodu ve vzorku na led a zmrazený preparát pozorovat v kryo SEM při teplotách pod -100 ˚C.

Některé techniky umožňují vytvářet prostorové modely pozorované oblasti. Při použití metody FIB (Focus Ion Beam) ozařujeme vzorek fokusovaným svazkem iontů, např. gallia, který jej postupně obrušuje a nově odhalené vrstvy jsou skenovány svazkem elektronů. Metoda SBF (Serial Block-Face) zase využívá ultramikrotom, který je zabudován v preparátové komoře a postupně odkrajuje povrch bločku se zalitým preparátem.

Povrch listu břečťanu s průduchy.

Povrch listu břečťanu (Hedera helix) s průduchy. (Rastrovací elektronový mikroskop JEOL7401F, Ing. Marie Šimková a Jiří Vaněček, Ústav molekulární biologie rostlin, Biologické centrum AV ČR, v.v.i., České Budějovice).

 

Lom střevem dospělé samičky klíštěte

Lom střevem dospělé samičky klíštěte Ixodes ricinus, která sála šest dní krev morčete. Na snímku je vidět střevní obsah s krystaly pravděpodobně hemoglobinu. Samička spolu s krví morčete přijme i velké množství železa, obsaženého právě v hemoglobinu. Vědci z Parazitologického ústavu Biologického centra AV ČR zjistili, že na transportu železa z trávicího traktu klíštěte do jiných orgánů se podílí bílkovina označená jako feritin 2. Potlačením tvorby feritinu 2 došlo k omezení schopnosti klíšťat sát na hostiteli. (Rastrovací elektronový mikroskop JEOL7401F, Mgr. Jana Schrenková a Jiří Vaněček, Parazitologický ústav, Biologické centrum AV ČR, v.v.i., České Budějovice)

Transmisní (prozařovací) elektronový mikroskop (TEM) dosahuje ještě větší rozlišovací schopnosti než SEM – až v řádu desetin nanometru. V biologickém a biomedicínském výzkumu je používán pro studium buněčné ultrastruktury, bakterií, virů, ale i izolovaných buněčných organel či makromolekulárních komplexů. Urychlené primární elektrony procházejí preparátem, rozptylují se na jeho atomech a v důsledku toho vzniká obraz. Elektromagnetické čočky ho mnohonásobně zvětší a nakonec je na stínítku TEM obraz konvertován do oblasti viditelného světla.

I zde je velkou nevýhodou, že preparáty nesmí obsahovat vodu. Navíc jejich tloušťka musí být pod penetračním limitem urychlených elektronů ve vzorku. V praxi to znamená, že pro TEM pracující s urychlovacím napětím 100 kV je třeba většinu preparátů nakrájet do podoby ultratenkých řezů s tloušťkou pod 100 nm. Pro představu: pokud list papíru, na kterém je vytištěn tento text, má tloušťku 0,1 mm, bylo by třeba jej rozřezat na tisíc plátků. Proto se vzorky pro TEM poměrně složitě připravují. Proces nejčastěji startuje chemickou fixací a končí zalitím preparátu do speciální pryskyřice, která jej pro krájení zpevní.

Trendem současné transmisní elektronové mikroskopie je pozorovat biologické vzorky ve zmrazeném stavu, což přináší nutnost krájet z vitrifikovaných, hluboce zamrazených preparátů ultratenké kryořezy. Tyto postupy jsou technicky a finančně velmi náročné, umožňují ale pozorovat biologické preparáty blíže nativnímu stavu a využít TEM i pro sledování dynamických jevů. Elektronová tomografie umožňuje vytvořit trojrozměrný model studovaného detailu rekonstrukcí z řady zaznamenaných projekcí při postupném naklánění vzorku. Navázáním protilátky nesoucí značku, která je dobře rozpoznatelná v TEM (zlatá nanočástice ve velikosti 5-15 nm), na hledanou molekulu (např. protein) můžeme lokalizovat její přesné umístění v buněčné ultrastruktuře a lépe odvodit například její funkci.

Ultrastruktura nervové buňky infikované virem klíštěcí encefalitidy.

Ultrastruktura nervové buňky infikované virem klíštěcí encefalitidy zachycená metodou elektronové tomografie. Ve středové části obr. A z TEM lze tušit několik virových částic. Z řady projekcí zaznamenaných při různém náklonu analyzované oblasti k dopadajícímu paprsku urychlených elektronů lze vytvořit trojrozměrný obraz. Výstupem je model na obr. B, který ukazuje, jak jsou virové částice (žlutě) obaleny váčky (zeleně), které vznikly modifikací membrány drsného endoplazmatického retikula (modře s červenými ribozomy). (Transmisní elektronový mikroskop JEOL2100F, autoři RNDr. Marie Vancová, PhD. a Mgr. Tomáš Bílý, Parazitologický ústav, Biologické centrum AV ČR, v.v.i.)

3D vizualizace ultrastruktury drsného endoplazmatického retikula nervové buňky infikované virem klíšťové encefalitidy. Metodou elektronové tomografie byl vytvořen virtuální třírozměrný obraz detailu drsného endoplazmatického retikula nervové buňky s několika virovými částicemi v jeho středu. Pro lepší orientaci byl vytvořen 3D model detailně ukazující umístění virových částic (žlutě označené) ve váčcích (zeleně označené), které vznikly modifikací membrány drsného endoplazmatického retikula (modře označena) s nasedlými ribozomy (červeně označeny).

Výčet mikroskopických technik využívaných biology zakončíme zmínkou o kombinaci metod světelné a elektronové mikroskopie. Tzv. korelativní mikroskopie (CLEM) umožňuje nalézt totožné místo na studovaném objektu pro zobrazení oběma technikami a spojuje tak informace získané za různých zvětšení a různých podmínek přípravy preparátu.

Poděkování

Tato práce byla podporována 7. rámcovým programem Evropské unie (FP7/2007-2013) za základě grantové dohody č. 316304, dále pak projektem ALGATECH plus (projekt v rámci Národního programu udržitelnosti – MSMT LO1416) a Českou grantovou agenturou (project GAČR GAČR P501–12–0304).

Naše osobní poděkování patří pánům inženýrům Janu Čerepjukovi a Tomáši Popovi z firmy Olympus za zajištění bezchybného technického servisu mikroskopického vybavení Entomologického ústavu Biologického centra AV ČR v Českých Budějovicích a za jejich ochotu kdykoli odborně poradit a pomoci.

 

Titulní foto: Průřez sítnicí složeného oka octomilky, vzniklý složením několika optických řezů pořízených konfokálním mikroskopem. Snímek slouží ke studiu expresní aktivity genů rodopsinu 5 (RH5) a rodopsinu 6 (RH6). Exprese Rh5 je zviditelněna pomocí reportérového genu lacZ (gen z bakterie E. coli kódující β-galaktozidázu), který je detekován protilátkou proti β-galaktozidáze (zeleně). Protein RH6 je detekován protilátkou proti Rh6 (červeně). Měřítko: 10 µm. (Laserový skenovací konfokální mikroskop Zeiss 510META, autorka Hana Sehadová.)

Print Friendly

Notes:

  1. Název mikroskopu je odvozen právě od konjugace (spojení) obrazu s fokální (ohiskovou) rovinou optické aparatury.

  2. Méně využívané konfokální mikroskopy s rotujícím diskem (Tandem Scaning Confocal Microscopy) se liší charakterem konfokálních clon a způsobem detekce obrazu. Konfokální clona zajišťuje obojí – bodové osvětlení celého vzorku i odfiltrování fluorescenčního ráření pocházejícího z rovin mimo rovinu zaostření. Konfokální clona obsahuje velké množstí otvorů (ať již spirálovitě uspořádaných kruhových otvorů – Nipkowovův disk nebo horizontálních a vertikálních štěrbin), které při rychlé rotaci disku zajistí konfokální obraz celé roviny zaostření snímatelný digitální kamerou. Na tomoto pricipu byl postaven první komerčně využívaný konfokální mikroskop (český patent M. Petráň a M. Hadravský, 1967) jehož základ tvořil jednoduchý rotující Nipkowovův disk a nelaserový zdroj světla.

  3. Kaňa Radek, 2013, Photosynth. Res. 116, 465-479

O autorovi

Hana Sehadová, Jana Nebesářová, Radek Kaňa

Mgr. Hana Sehadová, PhD (*1974) je absolventkou Biologické fakulty Jihočeské Univerzity v Českých Budějovicích, oboru Molekulární a buněčná biologie a genetika. Je členem vědeckého týmu Laboratoře molekulární chronobiologie a vedoucí Mikroskopického centra Oddělení molekulární biologie a genetiky na Entomologickém ústavu Biologického centra ČAV, v.v.i. v Českých Budějovicích. // Ing. Jana Nebesářová, CSc (*1958) je absolventkou VŠCHT v Praze. Od začátku své profesní kariéry se zabývá elektronovou mikroskopií. V současné době vede Laboratoř elektronové mikroskopie Biologického centra ČAV, v.v.i. v Českých Budějovicích a Přírodovědecké fakulty UK v Praze. // Mgr. Radek Kaňa, PhD (*1976) vystudoval obor Biofyzika na Palackého Univerzitě v Olomouci, působí na Mikrobiologickém ústavu ČAV, v.v.i., v Třeboni - Centrum ALGATECH. Zabývá se studiem fotosyntézy a dynamikou proteinů tylakoidní membrány.