Nobelova cena za překonání limitů optického mikroskopu

Nobelovu cenu za chemii pro rok 2014 získali Eric Betzig, Stefan W. Hell a William E. Moerner za vývoj fluorescenční mikroskopie se superjemným rozlišením, která optickému mikroskopu umožnila spatřit viry, jednotlivé molekuly bílkovin a další objekty menší než 0,2  mikrometru.

V roce 1873 podal německý fyzik Ernst Abbe matematický důkaz, že optický mikroskop klasické konstrukce nemůže dosáhnout lepšího rozlišení, než je polovina vlnové délky světla, v němž je objekt pozorován. V praxi to znamená, že nelze pozorovat objekty menší než asi 0,2 mikrometru, například detaily buněčných organel, viry, o jednotlivých molekulách ani nemluvě.

Objekty od svislé přerušované čáry vpravo nejsou klasickým optickým mikroskopem viditelné.  Zdroj: © Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences

Objekty od svislé přerušované čáry vpravo nejsou klasickým optickým mikroskopem viditelné. Zdroj: © Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences

Letošním laureátům Nobelovy ceny za chemii se tento limit podařilo obejít. Vyvinuli dvě metody, z nichž každá je založena na jiném principu, ale obě rozvíjejí techniku fluorescenční mikroskopie. Ta pracuje s fluorescenčními látkami, kterými lze označit vybrané molekuly (např. DNA nebo protein). Po excitaci zářením určité vlnové délky začne fluorescenční látka zářit, čímž jinak obtížně pozorovatelné mikroobjekty zviditelní. (Za objev a využití fluorescenčního proteinu GFP izolovaného z medúzy Aequorea victoria byla udělena Nobelova cena za chemii v roce 2008.)

Díky posunu rozlišení optické mikroskopie za hranici 0,2 mikrometru (200 nanometrů) lze pozorovat organely a jednotlivé molekuly uvnitř živých buněk, což je u elektronové mikroskopie vyloučeno. Vědci tak získali možnost sledovat například molekuly na synapsích mezi nervovými buňkami nebo chování proteinů spojených s rozvojem Parkinsonovy nebo Alzheimerovy choroby.

Mezioborovost letošní chemické ceny hezky vystihl Jan Havlík na Twitteru:

„Zhasínání“ fluorescence

Stefan W. Hell. Zdroj: Max-Planck-Institut für Biochemie

Stefan W. Hell. Zdroj: Max-Planck-Institut für Biochemie

První z metod, STED (stimulated emission depletion) mikroskopii v roce 1994 teoreticky popsal a v roce 2000 prakticky demonstroval Stefan Hell. Využívá dva laserové paprsky. Jeden excituje molekuly fluorescenční látky, které začnou zářit. Je však příliš široký, takže v zaznamenávaném signálu splývá záření z více molekul.

Druhý paprsek o jiné vlnové délce fluorescenci naopak „vypíná“. Má přitom na průřezu podobu kroužku s nulovou intenzitou uprostřed. V jeho středu proto fluorescence odrušena není, čímž dochází k významnému nárůstu rozlišení signálu zaznamenaného pomocí prvního z paprsků. Viz také krátký článeček Stanislava Vaňka Za limity optické mikroskopie (Vesmír 5/2008).

Oba laserové paprsky postupně nanometr po nanometru skenují povrch vzorku a skládají celkový obraz.

Součinnost obou paprsků vysvětluje video:

A podrobnější názorné vysvětlení nabízí i Společnost Maxe Plancka (anglicky):

 

Skládání obrázků

K vývoji druhé metody, „mikroskopii jedné molekuly“ (single-molecule microscopy) nezávisle na sobě přispěli Eric Betzig a William Moerner. Využívá velmi silné excitační záření, jehož působením elektrony přecházejí do tzv. tmavých stavů, z nichž se navracejí do základního stavu s větším zpožděním a náhodně. To znamená, že ve vzorku se postupně rozsvěcují náhodně rozmístěné jednotlivé molekuly fluorescenční látky. Zobrazují se sice jako body o průměru 200 nm, ale protože se jedná o jednotlivé molekuly, lze vypočítat jejich těžiště a zářící body lokalizovat do několika nanometrů. Pořídí-li se série velkého množství takových snímků, lze z nich následně složit obrázek celého vzorku ve vysokým rozlišením. První takový vznikl v roce 2006.

Princip mikroskopie jedné molekuly

Zdroj: © Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences

William E. Moerner (vlevo) a Eric Betzig. Zdroj: Janelia Farm Research Campus, Stanford University

William E. Moerner (vlevo) a Eric Betzig. Zdroj: Janelia Farm Research Campus, Stanford University

Zjednodušeně se tedy dá říci, že zatímco Hell snímá vzorek pouze jednou (byť pomocí dvou laserových paprsků), ale činí tak skenováním nanometr po nanometru, Moerner s Betzigem snímají celý vzorek najednou, zato opakovaně.

Laureáti

Stefan W. Hell (* 1962)

Narodil se v rumunském Aradu, má německé občanství. Vystudoval v Heidelbergu, dnes řídí Ústav Maxe Plancka pro biofyzikální chemii v Göttingenu, působí také v Německém výzkumném centru rakoviny v Heidelbergu.

Eric Betzig (*1960)

Narodil se v michiganském Ann Arbour (USA), vystudoval na Cornell University. Po úspěšném startu vědecké kariéry výzkumu v roce 1995 zanechal a odešel pracovat do firmy svého otce. Po několika letech se vrátil a v roce 2006 mu v Science vyšla práce popisující novou mikroskopickou techniku. Dnes působí jako vedoucí skupiny na Janelia Farm Research Campus, Howard Hughes Medical Institute.

William E. Moerner (* 1953)

Narodil se v kalifornském Pleasantonu (USA), vystudoval na Cornell University. Dnes působí na Stanfordově univerzitě.

 Titulní foto: Dendrity nervové buňky v mozku živé myši. snímek pořízený pomocí STED mikroskopie. Zdroj: MPI for Biophysical Chemistry

Print Friendly